張博，李鳳君，左中夫

糖尿病視網(wǎng)膜病變 (diabetic retinopathy，DR)人群不斷增加，晚期易導(dǎo)致失明，對患者的生活帶來沉重的負(fù)擔(dān)[1]。近年來研究證實(shí)神經(jīng)退行性變亦是DR的重要發(fā)病機(jī)制，且早于微血管病變[2]。因此，有效預(yù)防和治療DR神經(jīng)病變亦尤為重要。中醫(yī)中藥在防治糖尿病中扮演重要的角色[3]。芍藥苷為芍藥的主要成分,被證實(shí)具有降低血糖及神經(jīng)保護(hù)等作用[4]，近期研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷可通過HSP70/TLR4/NF-κB通路抑制小膠質(zhì)細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metallopeptidase-9，MMP-9）活化，從而改善 DR[5]，但對Müller細(xì)胞的影響還未見報(bào)道。因此，本研究通過芍藥苷對糖尿病大鼠灌胃治療，探討芍藥苷對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的影響，期望為DR治療策略的探討提供更全面的認(rèn)識。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及模型制備 SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量 220～240 g(購自錦州醫(yī)科大學(xué)，編號：SCXK(遼)2014-16)。動物飼養(yǎng)室溫25℃，濕度43%，自由攝食飲水。將動物隨機(jī)分成對照組、糖尿病組、芍藥苷組及二甲雙胍組，每組各10只。后3組大鼠采用單次腹腔注射STZ (50 mg·kg-1)，72 h后檢測尾靜脈血糖，將血糖濃度＞16.7 mmol·L-1的大鼠作為糖尿病模型。模型誘導(dǎo)成功后，依據(jù)文獻(xiàn)，芍藥苷組給予芍藥苷(20 mg·kg-1)灌胃治療[6]，每日2次。二甲雙胍組給予二甲雙胍(20 mg·kg-1)作為陽性對照[7]，溶于2 ml生理鹽水灌胃治療，每日1次。對照組、糖尿病組給予等劑量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)期間動態(tài)監(jiān)測大鼠血糖、體重變化。12 w后，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測，實(shí)驗(yàn)遵循國家《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》。

1.1.2 試劑及儀器 鹽酸二甲雙胍、鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)(美國 Sigma公司)；芍藥苷(98.78%，南京格倫生物科技有限公司)；神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)、膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(Glial glutamate transporter,GLAST)、谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)抗體(英國Abcam公司)；谷氨酸含量檢測試劑盒、熒光二抗及Western blot二抗(北京碧云天生物公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；冰凍切片機(jī)(德國SLEE公司)；水平電泳儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣本制備 12 w后，每組取4只大鼠，水合氯醛麻醉后經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛固定。固定完成后將大鼠眼球取出于固定液中，4℃保存，用于免疫熒光。每組取6只大鼠水合氯醛深度麻醉，取新鮮視網(wǎng)膜(左眼)于2.5 ml EP管中，依據(jù)重量加蛋白裂解液，冰上剪碎，4℃離心機(jī)25 min后取上清，-20℃保存用于Western blot；右眼視網(wǎng)膜稱重勻漿后加無水乙醇1 mL，離心20 min后取上清-20℃保存用于視網(wǎng)膜谷氨酸含量檢測。

1.2.2 視網(wǎng)膜谷氨酸含量檢測 視網(wǎng)膜谷氨酸含量檢測應(yīng)用可見分光光度法，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，按照蛋白濃度計(jì)算處視網(wǎng)膜谷氨酸濃度。

1.2.3 免疫熒光檢測大鼠視網(wǎng)膜GFAP、GLAST表達(dá) 將固定液中的眼球取出后用20%蔗糖溶液脫水，OCT包埋后切片，厚度為12 μm。載玻片于PBS洗滌3次，每次5 min；5%山羊血清+0.1%Triton-100室溫孵育30 min；不洗，滴加兔抗大鼠GFAP(1:700)、兔抗大鼠 GLAST(1:600)，4℃過夜；PBS 洗滌 3次，每次5 min；滴加山羊抗兔二抗，室溫避光2 h；PBS洗滌3次，每次5 min；封片后熒光顯微鏡觀察。

1.2.4 Western blot檢查大鼠視網(wǎng)膜GFAP、GLAST、GS相對表達(dá)量：BCA法測定蛋白濃度，確定電泳時(shí)加入15 μL樣品；開始電泳，調(diào)整電壓為90 V，待電泳條帶成一條直線時(shí)，調(diào)整電壓為120 V；半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜膜后取目的條帶，1%BSA室溫封閉2 h；加入一抗(兔抗大鼠GFAP，1:10000；兔抗大鼠GLAST，1:8000；兔抗大鼠 GS，1:8000)，4℃孵育過夜；TBST 洗滌4次，每次5 min；加入HRP標(biāo)記的二抗室溫2 h，孵育后TBST洗滌4次，每次5 min；ECL試劑盒顯影，Image J軟件分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，所有數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，計(jì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模前后血糖體重變化

大鼠造模前，4組體重之間比較 (F=0.59，P>0.05)，血糖之間比較(F=1.38，P>0.05)，兩者均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。造模12 w后，4組之間相比，體重(F=2.42，P＜0.01)、血糖(F=26.63，P＜0.01)，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對照組相比，糖尿病組、芍藥苷組及二甲雙胍組大鼠體重明顯降低，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，而3組之間比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

與對照組相比，糖尿病組血糖均>16.7mmol·L-1，與糖尿病組比較，芍藥苷組血糖有所下降但仍高于正常，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，二甲雙胍組與對照組之間未見明顯差異(P>0.05)。見表1、圖1

表1 各組大鼠血糖(mmol·L-1)、體重(g)(，n=10)

表1 各組大鼠血糖(mmol·L-1)、體重(g)(，n=10)

注：*與對照組相比，P＜0.01

組別 血糖 體重造模前 造模前 造模后3個(gè)月對照組 4.31±0.12 224.01±13.14 415.45±14.64糖尿病組 4.45±0.64 235.15±12.51 246.81±13.59*芍藥苷組 4.33±0.39 236.52±16.32 251.42±13.49*二甲雙胍組 4.43±0.27 226.72±15.36 249.22±12.04*造模后3個(gè)月4.43±0.67 18.25±1.45*8.52±1.29*4.42±0.38

2.1 視網(wǎng)膜谷氨酸含量檢測

4組之間視網(wǎng)膜谷氨酸含量比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=720.05，P＜0.01)。同對照組比較，糖尿病組谷氨酸含量明顯升高(P＜0.01)。同糖尿病組比較，芍藥苷組及二甲雙胍組谷氨酸含量明顯下降(P＜0.01)。見表2

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜谷氨酸含量(，n=6)及免疫熒光檢測各蛋白表達(dá) (，n=4)

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜谷氨酸含量(，n=6)及免疫熒光檢測各蛋白表達(dá) (，n=4)

注：*與對照組相比，P＜0.01；#與糖尿病組相比，P＜0.01

組別 谷氨酸含量(μmol/g)GFAP熒光強(qiáng)度(%)GLAST熒光強(qiáng)度(%)對照組 23.71±0.94 100.00±0.00 100.00±0.00糖尿病組 43.53±0.86* 175.54±2.47* 68.48±1.26*芍藥苷組 31.56±0.93# 146.37±1.4# 81.53±2.47#二甲雙胍組 32.38±0.72# 99.52±1.55# 98.72±0.98#

2.2 免疫熒光檢測結(jié)果

GFAP在對照組主要微量表達(dá)于視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層，將對照組GFAP蛋白免疫熒光強(qiáng)度設(shè)定為100.00%，熒光強(qiáng)度分析結(jié)果，4組之間比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3226.47，P＜0.01)。 同對照組比較，糖尿病組熒光強(qiáng)度明顯升高(P＜0.01)。同糖尿病組比較，芍藥苷組及二甲雙胍組熒光強(qiáng)度均不同程度下降且二甲雙胍組下降更明顯(P＜0.01)。見表2、圖1

GLAST在視網(wǎng)膜各層均有表達(dá)，將對照組GLAST蛋白免疫熒光強(qiáng)度設(shè)定為100.00%，熒光強(qiáng)度分析結(jié)果：4組之間比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=587.19，P＜0.01)。 同對照組相比，糖尿病組 GLAST 熒光強(qiáng)度明顯下降(P＜0.01)，同糖尿病組比較，芍藥苷組及二甲雙胍組熒光強(qiáng)度明顯升高且二甲雙胍組升高更明顯(P＜0.01)。 見表 2、圖 1

2.3 Western bolt檢測 GFAP、GLAST、GS 蛋白相對表達(dá)量

GFAP蛋白相對表達(dá)量：4組之間比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=423.02，P＜0.01)。同對照組比較，糖尿病組GFAP表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，同糖尿病組比較，芍藥苷組及二甲雙胍組GFAP均顯下降(P＜0.01)。見表3、圖2

GLAST蛋白相對表達(dá)量：4組之間比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=129.56,P＜0.01)。同對照組比較，糖尿病組GLAST表達(dá)明顯減少(P＜0.01)，而同糖尿病組比較，芍藥苷組及二甲雙胍組GLAST表達(dá)明顯增加(P＜0.01)。 見表 3、圖 2

GS蛋白相對表達(dá)量：4組之間比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.84,P＜0.01)。同對照組比較，糖尿病組GS表達(dá)明顯減少(P＜0.01)，而同糖尿病組比較，芍藥苷組與二甲雙胍組GS表達(dá)明顯增加(P＜0.01)。見表3、圖2

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜蛋白相對表達(dá)量(，n=6)

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜蛋白相對表達(dá)量(，n=6)

注：*與對照組相比，P＜0.01；#與糖尿病組相比，P＜ 0.01

組別 GFAP(%) GLAST(%) GS(%)對照組 8.60±0.59 17.81±1.17 35.94±1.04糖尿病組 22.85±1.02* 8.91±0.62* 22.94±0.64*芍藥苷組 16.28±0.88# 12.67±1.01# 30.07±1.40#二甲雙胍組 8.74±0.63# 16.92±0.75# 34.03±0.88#

圖1 免疫熒光檢測各組大鼠視網(wǎng)膜GFAP(紅色)、GLAST(綠色)的表達(dá)(箭頭示陽性表達(dá)，×200)。對照組：GFAP主要微量表達(dá)于節(jié)細(xì)胞層，GLAST在視網(wǎng)膜各層均有表達(dá)；糖尿病組：GFAP表達(dá)明顯增強(qiáng)，貫穿于視網(wǎng)膜全層，而GLAST表達(dá)較對照組明顯減少；芍藥苷組：與糖尿病組相比，GFAP表達(dá)有所減少，但仍高于對照組，而GLAST表達(dá)高于糖尿病組但低于對照組。二甲雙胍組：與對照組相比，GFAP與GLAST表達(dá)無明顯差別。 GCL:節(jié)細(xì)胞層；IPL:內(nèi)叢狀層；INL:內(nèi)核層；OPL:外叢狀層；ONL:外核層

圖2 Western blot檢測GFAP、GLAST、GS蛋白相對表達(dá)量。A對照組；B糖尿病組；C芍藥苷組；D二甲雙胍組

3 討論

近年研究顯示DR發(fā)病率逐年攀升，已經(jīng)成為發(fā)達(dá)國家成年人視力失明最主要的原因[8-9]。DR在我國的發(fā)病率也極高，最新發(fā)布的《中國2型糖尿病防治指南》就明確指出，DR在我國已經(jīng)成為成年人致盲的首要因素。DR的高致盲率增加了患者心理及生理負(fù)擔(dān)。神經(jīng)病變?yōu)槲⒀懿∽冎鈪⑴cDR的重要原因。因此，有效預(yù)防和治療DR神經(jīng)病變亦尤為重要。

中醫(yī)中藥在防治糖尿病中扮演重要的角色[3]。芍藥苷為芍藥的主要成分,具有降低血糖及神經(jīng)保護(hù)等作用[4]，本研究證實(shí)芍藥苷可以降低糖尿病大鼠的血糖，但效果低于二甲雙胍。近期研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷可通過HSP70/TLR4/NF-κB信號通路抑制小膠質(zhì)細(xì)胞MMP-9激活，從而改善DR[5]，但對Müller細(xì)胞的影響還未見報(bào)道。Müller細(xì)胞占視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞的90%左右，在視網(wǎng)膜貫穿全層。Müller細(xì)胞具有支持及營養(yǎng)神經(jīng)元的作用，Müller細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能異常與DR發(fā)病關(guān)系密切[10]。GFAP是膠質(zhì)細(xì)胞特有的標(biāo)志性蛋白，特異性表達(dá)于膠質(zhì)細(xì)胞，但Müller細(xì)胞幾乎不表達(dá)GFAP，僅當(dāng)Müller細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能異常時(shí)可見GFAP表達(dá)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，正常情況下僅在視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層中有少量的GFAP蛋白表達(dá)，但DR狀態(tài)下視網(wǎng)膜不僅神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層GFAP表達(dá)明顯增加，而且免疫熒光觀察到視網(wǎng)膜GFAP陽性染色纖維分布空間范圍廣泛，幾乎貫穿視網(wǎng)膜神經(jīng)組織全層，其分布范圍與Müller細(xì)胞空間位置相同。而應(yīng)用芍藥苷后可見糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)GFAP表達(dá)明顯減少。該結(jié)果提示，芍藥苷可能通過有效抑制DR狀態(tài)下視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞活化，可能對視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞起到保護(hù)作用。

GLAST為Müller細(xì)胞中最主要的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，主要表達(dá)于Müller細(xì)胞胞體和突起。GLAST可對視網(wǎng)膜突觸間隙內(nèi)過多的谷氨酸給予清除，從而大大減少其興奮毒性。Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜中唯一能合成GS的細(xì)胞，GS是Müller細(xì)胞的功能酶，能將轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)的谷氨酸轉(zhuǎn)化為無毒谷氨酰胺[12]，從而降低谷氨酸的細(xì)胞毒性，保護(hù)視網(wǎng)膜[13]。糖尿病狀態(tài)下，視網(wǎng)膜中谷氨酸堆積，能產(chǎn)生神經(jīng)毒性，誘發(fā)并加重DR[14]。本研究顯示，糖尿病狀態(tài)下GFAP表達(dá)顯著增加，說明大Müller細(xì)胞已受損，而GFAP表達(dá)增加時(shí)GLAST、GS表達(dá)減少，谷氨酸含量增加，在給予芍藥苷后GFAP表達(dá)減少同時(shí)GLAST、GS在Müller細(xì)胞中的表達(dá)增加，谷氨酸含量降低。該結(jié)果進(jìn)一步提示，芍藥苷可能通過抑制視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞活化進(jìn)而改善了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的功能。這提示芍藥苷可能對于改善DR具有重要的意義。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷可通過抑制DR狀態(tài)下視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞活化，上調(diào)視網(wǎng)膜GLAST、GS表達(dá)，降低視網(wǎng)膜谷氨酸含量，提示芍藥苷對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病Müller細(xì)胞具有保護(hù)作用。這一發(fā)現(xiàn)對研究DR的治療策略提供了新的方向。但因DR發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，芍藥苷對DR的作用可能涉及眾多途徑，因此芍藥苷對糖尿病視網(wǎng)膜病變的影響及機(jī)制仍待深入探討。