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(1.重慶工商大學環(huán)境與資源學院,重慶 400067; 2.天然藥物研究重慶高校市級重點實驗室,重慶 400067; 3.重慶工商大學評估與督導辦公室,重慶 400067)

越來越多的證據(jù)顯示,在細胞損傷、癌癥、衰老和動脈粥樣硬化等眾多人類疾病的發(fā)病機制中,自由基和活性氧產生了相當大的危害[1],自由基也會導致食物的脂質過氧化從而引起食物變質[2]。雖然通過添加合成抗氧化劑(如二丁基羥基甲苯(BHT)、丁基羥基茴香醚(BHA)和特丁基對苯二酚(TBHQ)),可以預防食品氧化,但是由于這些人工合成抗氧化劑存在一定的安全問題,最近對天然抗氧化劑的關注越來越多[3]。近年來,人們對水果、蔬菜、種子、茶葉、葡萄酒和許多植物中的天然抗氧化劑進行了廣泛的研究,因為這些天然抗氧化劑,如多酚、黃酮類化合物和維生素,做為抗氧化損傷的化學預防劑,能有效清除自由基,減少對細胞造成的損傷,并參與調節(jié)體內氧化-抗氧化平衡,能有效防止某些氧化相關慢性疾病[4-5]。

山奈(KaempferiagalangaL.),又名沙姜、三賴、山辣和三奈等,多年生宿根草本植物,原產于熱帶地區(qū),我國主產廣西和廣東兩省區(qū)。山奈氣芳香且濃烈、味辛辣,既是著名的食物調料,又是著名的香料。同時山奈有行氣、溫中和止痛的功效,2014年,被中華人民共和國衛(wèi)計委增列為食藥兩用中藥材物質?，F(xiàn)代藥理研究表明,山奈具有抑制胃潰瘍[6]、鎮(zhèn)痛[7]、鎮(zhèn)靜[8]、抗癌[9]、防曬10]和抗氧化[11-13]等功效。山奈藥食兩用、食用安全,粗提物已發(fā)現(xiàn)有較好的抗氧化活性,但是報道很少。

山奈提取物活性測試較為簡單,且主要集中在其乙醇提取物對食用油脂的抗氧化活性研究,為進一步明確山奈的抗氧化活性,確定山奈抗氧化活性部位,便于進一步尋找其抗氧化活性成分,從中篩選出高效、安全的天然抗氧化劑,更好地開發(fā)利用山奈資源,本實驗制備了山奈乙醇提取物和石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水余相等5個萃取部位,并分別采用DPPH和ABTS法測試了提取物和各萃取部位的抗氧化活性,以期確定山奈抗氧化活性部位,為進一步的抗氧化活性成分研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山奈 重慶市某生活超市,產地為廣西桂平;1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS) 99.9%,Sigma公司;抗壞血酸(VC) 分析純,廣東光華科技股份有限公司;過硫酸鉀、95%乙醇、石油醚(60～90 ℃)、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇 均為分析純。

U-2910型紫外可見分光光度計 日立高新技術公司;SQP分析電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;RE-52AA型旋轉蒸發(fā)器 上海賢德實驗儀器有限公司;DZF-1B(6050)型真空干燥箱 上海龍躍儀器設備有限公司;DHG-9036A電熱恒溫鼓風干燥箱 北京京科瑞達科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乙醇總提物和萃取部位的制備 山奈置60 ℃烘箱干燥1 h后,粉碎,過60目篩,稱取山奈粉75 g,按1∶20 (g/mL)的固液比,用體積分數(shù)為80%的乙醇溶液浸泡1 h后,在超聲功率250 W下超聲波提取45 min,真空抽濾,重復提取3次,合并提取液,放入旋轉蒸發(fā)儀中,60 ℃下減壓回收至無醇味,得總提取液V(總)mL;取一定量體積V(1)mL總提取液置蒸發(fā)皿中,60 ℃、15 kPa下真空干燥,得到乙醇總提物M g;余下的總提取液V(2)mL,按1∶1 (V/V)的體積比依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇各萃取4次,每次靜置24 h,相同萃取相合并,減壓濃縮,然后在60 ℃、15 kPa下真空干燥,依次得到石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水余相5個部位。

得率計算公式:

醇提物得率(%)=(M(醇提物)×(V(總)/V(1)))/M(總)×100

部位得率(%)=(M(相)×(V(總)/V(2)))/M(總)×100

式中,M(醇提物)為V(1)mL總提取液濃縮、干燥后質量,g;V(總)為總提取液體積mL;V(1)為總提取液中取出制備M(醇提物)的體積,mL;M(總)為稱取的山奈粉質量,g;M(相)為每個萃取相濃縮、干燥后質量,g。

1.2.2 測試液的配制 乙醇提取物配制:準確稱取乙醇提取物0.1000 g,用95%的乙醇配成質量濃度4.0 mg/mL的溶液,再按比例依次稀釋,配成質量濃度為2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg/mL的樣液備用。

石油醚相配制:準確稱取石油醚萃取部位0.4000 g,用95%的乙醇配成質量濃度為16.0 mg/mL的溶液,再按比例依次稀釋,配成質量濃度為8.0、4.0、2.0、1.0、0.5 mg/mL的樣液備用。

氯仿相配制:準確稱取氯仿萃取部位0.0500 g,用95%的乙醇配成質量濃度為2.0 mg/mL的溶液,再按比例依次稀釋,配成質量濃度為1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL的樣液備用。

乙酸乙酯相配制:準確稱取乙酸乙酯萃取部位0.0500 g,用95%的乙醇配成質量濃度為2.0 mg/mL的溶液,再按比例依次稀釋,配成質量濃度為1.0、0.5、0.25、0.125 mg/mL的樣液備用。

正丁醇相配制:準確稱取正丁醇萃取部位0.2000 g,用95%的乙醇配成質量濃度為8.0 mg/mL的溶液,再按比例依次稀釋,配成質量濃度為4.0、2.0、1.0、0.5 mg/mL的樣液備用。

水余相配制:準確稱取水余液部位1.0000 g,用蒸餾水配成質量濃度為40 mg/mL的溶液,再按比例依次稀釋,配成質量濃度為20.0、10.0、5.0、2.5 mg/mL的樣液備用。

VC陽性對照的配制:準確稱取VC0.0150 mg,用蒸餾水定容至25.00 mL,得0.6 mg/mL的抗壞血酸溶液,再依次稀釋配制質量濃度為0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125 mg/L的樣品溶液。

1.2.3 DPPH法測試抗氧化活性 參考Pan等[14]和項昭保[15]的方法,準確稱取25.0 mg DPPH試劑,用無水乙醇完全溶解后轉移至25.00 mL容量瓶中定容,制備得濃度為1.0 mg/mL DPPH溶液,再按比例稀釋,配成質量濃度為0.04 mg/mL的DPPH溶液備用。取0.50 mL不同濃度的待測液,再加入4.50 mL的DPPH溶液,在室溫避光環(huán)境下靜置30 min,再在517 nm處測定其吸光值。按下列公式計算VC及各部位對DPPH自由基的清除率:

DPPH自由基清除率(%)=(A0-Ai)/A0×100

其中:S為DPPH自由基清除率,%;A0為0.50 mL無水乙醇與4.50 mL DPPH溶液的吸光值;Ai為0.30 mL樣品溶液與2.70 mL DPPH溶液的吸光值。

通過測定山奈不同部位對DPPH自由基的清除率,得到山奈各部位不同濃度-DPPH自由基回歸方程,根據(jù)方程計算DPPH自由基清除率為50%時的SC50。

計算公式:

SC50=50%×加入DPPH質量/加入試樣溶液中溶質質量

1.2.4 ABTS法測試抗氧化活性 參照Xiang等[16]的方法,用95%乙醇配制7.4 mmol/L ABTS溶液,以及蒸餾水配制2.6 mmol/L的K2S2O8溶液,吸取兩種溶液各10.00 mL混合,置于室溫黑暗環(huán)境下12 h，使其充分反應后制得ABTS母液,之后用95%的乙醇稀釋30倍,得到ABTS工作液。用移液管準確移取ABTS溶液4.00 mL,再分別加入不同濃度的樣品溶液1.00 mL,振蕩10 s使其充分混合后,再于室溫避光下靜置6 min,在734 nm處測定其吸光度。按下列公式計算VC及山奈各部位對ABTS自由基的清除率:

ABTS自由基清除率(%)=(A0-Aj)/A0×100

其中:A0為1.00 mL 95%乙醇與4.00 mL ABTS·工作液的吸光值;Aj為1.00 mL樣品溶液與4.00 mL ABTS·工作液的吸光值。

通過測定山奈不同部位對ABTS自由基的清除率,得到山奈各部位不同濃度-ABTS自由基回歸方程,根據(jù)方程計算ABTS自由基清除率為50%時的SC50。

計算公式:

SC50=50%×加入ABTS質量/加入試樣溶液中溶質質量

1.3 數(shù)據(jù)處理

抗氧化活性測試實驗平行三次,結果以平均值±標準差表示。測得的實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20統(tǒng)計軟件進行回歸方程分析。

2 結果與分析

2.1 山奈乙醇總提物和各部位的得率

根據(jù)得率計算公式,乙醇提取物得率達13.43%,說明超聲提取4次,山奈有效成分基本轉移到乙醇溶液中,有效成分提取完全。從圖1可以看出,山奈不同部位得率從高到低依次是:水余相>正丁醇相>石油醚相>氯仿相>乙酸乙酯相,說明山奈中化學成分主要是極性大的正丁醇相和水余相,以及極性小的石油醚相,這與其常作為食用調料燉煮(大極性)和香料香精(小極性)的用法相匹配[17]。中等極性的乙酸乙酯相和氯仿相得率較低,分別為0.33%和0.48%。進一步的活性成分研究,應根據(jù)活性部位極性大小,選擇相應極性的溶劑提取和進一步的分離純化。

圖1 山奈不同部位的得率Fig.1 Yield ratio of different extracts of Kaempferia galanga L.

2.2 DPPH法篩選抗氧化活性部位

從圖2～圖5可知,山奈乙醇提取物及各萃取部位均有清除DPPH自由基的能力,其中氯仿相對DPPH自由基清除能力最好,但較陽性對照VC對DPPH自由基清除能力,還有一定差距;其次是乙酸乙酯相;乙醇提取物和正丁醇相也有較好的DPPH自由基清除能力,石油醚相和水余相的DPPH自由基清除能力比較差。且在試驗濃度線性范圍內,各部位清除DPPH自由基的能力隨著濃度的增加而增加,其抗氧化能力也相應增高。但隨著濃度增加到一定量后,每個部位對DPPH自由基清除能力的增長趨勢由快逐漸變慢。其原因可能是DPPH自由基存在單電子,其單電子在自由基清除劑存在時與之配對,從而隨自由基清除劑吸收逐漸消失,溶液顏色也逐漸褪色[18]。在測試樣液濃度較低時,DPPH溶液中的單電子數(shù)多于自由基清除劑,因此DPPH自由基清除能力增長趨勢較快;而當測試樣液濃度較大時,單電子數(shù)和自由基清除劑基本達到飽和,因此自由基清除能力增長趨勢變緩。

圖2 VC對DPPH自由基的清除作用Fig.2 Scavenging capacity against DPPH· of VC

圖3 乙酸乙酯相和氯仿相對DPPH自由基的清除作用Fig.3 Scavenging capacity against DPPH· of chloroform fraction and ethyl acetate fraction from Kaempferia galanga L.

圖4 乙醇總提物和正丁醇相對DPPH自由基的清除作用Fig.4 Scavenging capacity against DPPH· of ethanol extract and n-butanol fraction from Kaempferia galanga L.

圖5 石油醚相和水余相對DPPH自由基的清除作用Fig.5 Scavenging capacity against DPPH· of petroleum ether fraction and water fraction from Kaempferia galanga L.

從圖2～圖5可以看出,山奈提取物和各部位的濃度與DPPH自由基清除活性并不呈線性關系,所以根據(jù)濃度-DPPH自由基清除率關系,做回歸方程后,計算出其半清除濃度(SC50),SC50越小,其抗氧化活性越大。由表1中SC50可知,DPPH自由基清除作用的強弱順序依次為:VC>氯仿相>乙酸乙酯相>正丁醇部相>乙醇總提物>石油醚相>水余相。乙醇提取物SC50為1.5422 mg/mL,體現(xiàn)出良好的體外抗氧化活性,石油醚相SC50為1.7573 mg/mL,活性稍弱于乙醇提取物;水余相濃度達40 mg/mL時,對DPPH自由基的清除率仍達不到60%,SC50達到21.9276 mg/mL,因此對DPPH自由基的清除活性差?；钚詮娪谝掖继崛∥锏穆确孪嗟腟C50,大約是VC的4倍,乙酸乙酯相的SC50大約是VC的9倍,正丁醇相的SC50大約是VC的35倍。由此可見,山奈氯仿相的抗氧化活性好,是山奈的主要抗氧化活性部位,有望從中分離得到抗氧化活性很好的天然抗氧化劑。乙酸乙酯相的SC50大約是氯仿相的2.3倍,也具有良好的抗氧化活性。

表1 山奈乙醇提取物、各部位及VC對DPPH自由基清除率的回歸方程和SC50Table 1 Regression equation and SC50 against DPPH· of ethanol extract and fractions from Kaempferia galanga L.

2.3 ABTS法篩選抗氧化活性部位

圖6～圖9可以看出,山奈提取物和各部位都具有清除ABTS自由基的能力,且在試驗濃度線性范圍內,各部位清除ABTS自由基的能力隨著濃度的增加而增加。氯仿相和乙酸乙酯相清除ABTS自由基能力很好,在較低濃度下,就能達到較好清除效果,但低于陽性對照VC。石油醚相和水余相ABTS自由基能力較差,正丁醇相和乙醇總提物居中。

圖6 VC對ABTS自由基的清除作用Fig.6 Scavenging capacity against ABTS· of VC

圖7 乙酸乙酯相和氯仿相對ABTS自由基的清除作用Fig.7 Scavenging capacity against ABTS· of chloroform fraction and ethyl acetate fraction from Kaempferia galanga L.

圖8 乙醇總提物和正丁醇相對ABTS自由基的清除作用Fig.8 Scavenging capacity against ABTS· of Ethanol extract and n-butanol fraction from Kaempferia galanga L.

圖9 石油醚部位和水余相部位對ABTS自由基的清除作用Fig.9 Scavenging capacity against ABTS·of petroleum ether fraction and water fraction from Kaempferia galanga L.

從圖6～圖9可以看出,山奈提取物和各部位的濃度與ABTS自由基清除活性并不呈線性關系,所以根據(jù)濃度-ABTS自由基清除率關系,做回歸方程后計算SC50。由表2可知,ABTS自由基清除作用的強弱順序依次為:VC>氯仿相>乙酸乙酯相>乙醇總提物>正丁醇相>石油醚相>水余相,乙醇提取物的SC50大約是VC的10倍,顯示出山奈乙醇提取物具有良好的抗氧化活性。氯仿相的SC50不到VC的2倍,乙酸乙酯相的SC50不到氯仿部位的3倍,進一步說明氯仿相具有良好的抗氧化活性,乙酸乙酯相活性稍弱。正丁醇相的SC50約為氯仿相的10倍,但其得率是氯仿相的4倍,在抗氧化方面也有一定的應用價值。石油醚相的SC50約為氯仿相的32倍,抗氧化活性較差,在山奈中含量為氯仿相的3倍,近年來發(fā)現(xiàn)石油醚相抑菌活性良好[19],應加強其在抑菌方面的應用。水余相濃度在40 mg/mL時,對ABTS自由基的清除率接近100%,強于其對DPPH自由基的清除率,但SC50也達到6.2119 mg/mL,接近VC的76倍,氯仿部位的47倍,因此對ABTS清除活性差。水余相在這5個部位中,得率最高,抗氧化活性最差,今后的研究應著重水余相其它活性的篩選和進一步的產品開發(fā)。

表2 山奈乙醇提取物、各部位及VC對ABTS自由基清除率的回歸方程和SC50Table 2 Regression equation and SC50 against ABTS· of ethanol extract and fractions from Kaempferia galanga L.

3 結論

山奈乙醇提取物中各萃取部位得率從高到低依次為水余相、正丁醇相、石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相。山奈的醇提物對DPPH和ABTS自由基都具有良好的清除能力,所以山奈具有良好的抗氧化活性;山奈的氯仿相在兩種方法中都表現(xiàn)出明顯的清除自由基的能力,其對ABTS的SC50約為陽性對照VC的2倍,對DPPH的SC50約為陽性對照VC的4倍,是山奈主要的抗氧化活性部位,從山奈中尋找天然抗氧化劑應重點在其氯仿相中篩選。