楊瑤瑤，朱婷婷，王 瑤

（1西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔預(yù)防保健科，四川瀘州 646000；2煙臺(tái)市口腔醫(yī)院兒童牙科）

2006年Sonoyama W從人年輕恒牙根尖乳頭中成功分離出根尖乳頭干細(xì)胞(stem cells from apical papilla，SCAPs)，有研究發(fā)現(xiàn)SCAPs具有自我更新及形成牙本質(zhì)、成骨等多向分化能力[1]。低能量LED藍(lán)光照射生物組織，可調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[2]，提高不同類型細(xì)胞的增殖和分化能力[3]，如乳牙牙髓干細(xì)胞[4]、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及心肌干細(xì)胞[5]、人皮膚細(xì)胞[6]等。LED藍(lán)光是一種安全、有效的窄譜光源，對(duì)正常組織細(xì)胞幾乎無(wú)毒性，其促進(jìn)細(xì)胞分化抑制細(xì)胞增殖的作用要強(qiáng)于紅光[7]。但既往研究主要集中在紅光和激光，對(duì)LED藍(lán)光的涉入較少，在牙源性干細(xì)胞方面的研究更少。目前，LED藍(lán)光對(duì)SCAPs增殖的影響尚不明確，評(píng)估LED藍(lán)光對(duì)SCAPs增殖的影響，為實(shí)驗(yàn)研究和臨床治療方法提供參考具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

胎牛血清（四季青，中國(guó)）；DMEM/LOW（Hy-Clone，美國(guó)）；I型膠原酶（Biosharp，美國(guó)）；Dispase酶（Yeasen，美國(guó)）；小鼠抗人CD146、小鼠抗人CD45（Ebioscience，美國(guó)）；小鼠抗人 CD90、小鼠抗人CD105（三箭生物，中國(guó)）；MTT粉劑（Biosharp，美國(guó)）；流式細(xì)胞儀（Biorad，美國(guó)）；LED藍(lán)光（桂林市啄木鳥(niǎo)，中國(guó)）；能量測(cè)光表（桂林市啄木鳥(niǎo)，中國(guó)）；全光譜分光光度計(jì)（SBK-YLQX，美國(guó)）。

1.2 SCAPs的分離、培養(yǎng)、鑒定

細(xì)胞組織取自根尖未閉合的年輕恒牙，主要來(lái)源于本地口腔醫(yī)院因正畸治療需要拔除的前磨牙或阻生牙。患者健康無(wú)全身性疾病，牙體完整無(wú)病變，根尖未閉合無(wú)炎癥。將根尖乳頭組織清洗、剪碎、離心，加入1 mL I型膠原酶（3 mg/mL）和1 mL Dispase酶（4 mg/mL），370C孵育15～30 min，吹打呈絮狀，終止消化，離心后接種培養(yǎng)。鏡下見(jiàn)組織塊周?chē)?xì)胞爬出，每3 d換液。單克隆純化原代SCAPs，消化擴(kuò)大培養(yǎng)。取生長(zhǎng)狀態(tài)旺盛的第2代SCAPs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)SCAPs表面抗原CD90、CD146、CD105、CD45。

1.3 MTT法檢測(cè)低能量LED藍(lán)光干預(yù)下SCAPs的增殖情況

低能量LED藍(lán)光420～470 nm，光源距細(xì)胞層面1 cm，光功率密度100 mW/cm2。實(shí)驗(yàn)分為成骨誘導(dǎo)（ODM）組與普通培養(yǎng)基（DMEM）組，每組又分為非光照組A及光照組B～E，光照組分別以1、2、3和4 J/cm2為照射劑量，暗房?jī)?nèi)同一個(gè)人定時(shí)定點(diǎn)隔天光照。光照能量密度計(jì)算公式：能量密度=能量功率×?xí)r間。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期第3代SCAPs，以4×103/孔接種于96孔板，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，次日隨機(jī)分組并進(jìn)行光照，ODM組更換成骨誘導(dǎo)液，DMEM組更換普通培養(yǎng)液，每3 d換液。光照時(shí)細(xì)胞均移出孵箱，置于暗房?jī)?nèi)，根據(jù)不同光照強(qiáng)度進(jìn)行光照。MTT檢測(cè)第1、3、5、7和9 d的各組OD值。移除孔內(nèi)原培養(yǎng)基，各孔分別注入200 μL低糖DMEM，避光下各孔再注入20 μL 5 mg/mL MTT液，避光孵育4 h。去盡孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入150 μL/孔二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)。搖床上震搖10～20 min，全光譜分光光度計(jì)490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的吸光值（OD），根據(jù)時(shí)間和OD值，繪制SCAPs的生長(zhǎng)曲線圖。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Type III Tests of Fixed Effectsa統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，P＜0.05表明各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 人根尖乳頭干細(xì)胞(SCAPs)的分離培養(yǎng)、純化及鑒定

年輕恒牙根尖牙乳頭組織呈淡粉紅色，質(zhì)軟，易與牙髓組織分離（圖1）；原代培養(yǎng)5 d后鏡下見(jiàn)細(xì)胞從組織塊邊緣長(zhǎng)出，細(xì)胞形態(tài)多為長(zhǎng)梭形，形成生長(zhǎng)暈（圖2）；流式細(xì)胞儀鑒定第2代SCAPs表面抗原測(cè)定結(jié)果為：CD105陽(yáng)性率98.31%、CD146陽(yáng)性率45.20%、CD90陽(yáng)性率99.90%和CD45陰性率0.02%（圖3）。

圖1 人根尖牙乳頭組織

圖2 第5 d細(xì)胞從貼壁組織塊長(zhǎng)出(×40)

圖3 流式細(xì)胞儀鑒定第2代SCAPs表面抗原測(cè)定結(jié)果

2.2 低能量LED藍(lán)光干預(yù)下SCAPs增殖情況

根據(jù)MTT檢測(cè)數(shù)據(jù)繪制SCAPs的生長(zhǎng)曲線(圖4)?？梢?jiàn)各實(shí)驗(yàn)組SCAPs第1～3 d為緩慢增殖期、第3～7 d為快速增殖期、第7～9 d為穩(wěn)定期，各組總增殖趨勢(shì)近似“S”形曲線。每個(gè)組SCAPs增殖情況結(jié)果見(jiàn)表1、2。相同培養(yǎng)基中，ODM組中第3、5、7和9 d各時(shí)間點(diǎn)光照組增殖速率低于非光照組，其中2、3和4 J/cm2與0 J/cm2具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），第3、5 d各光照能量梯度之間增殖速率也存在一定差異。DMEM組中1、2、3、4 J/cm2增殖速率高于0J/cm2，但并無(wú)完全具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第5、7、9 d光照組4 J/cm2增殖速率高于非光照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。如圖5示相同光照強(qiáng)度下，DMEM組SCAPs增殖速率均高于ODM組，第3、5、7和9 d光照組2、4 J/cm2差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。

圖4 低能量LED藍(lán)光干預(yù)下SCAPs生長(zhǎng)曲線

表1 低能量LED藍(lán)光對(duì)SCAPs ODM組增殖能力的影響（OD490值）

表1 低能量LED藍(lán)光對(duì)SCAPs ODM組增殖能力的影響（OD490值）

注：a與非光照組對(duì)比，P＜0.05；實(shí)驗(yàn)亞組兩兩比較：b與1 J/cm2光照能量比較，P＜0.05；c與2 J/cm2光照能量比較，P＜0.05；d與3 J/cm2光照能量比較，P ＜ 0.05

光能量密度（J/cm2）照射天數(shù)0 1 2 3 4第1 d 0.448±0.054 0.537±0.017a 0.480±0.022b 0.340±0.062abc 0.476±0.025bd第3 d 0.750±0.014 0.727±0.012a 0.710±0.031a 0.608±0.029abc 0.612±0.029abc第5 d 1.414±0.068 1.280±0.046a 0.967±0.049ab 1.136±0.090abc 1.110±0.105abc第7 d 1.744±0.054 1.635±0.118 1.553±0.096a 1.584±0.076a 1.561±0.094a第9 d 1.696±0.116 1.515±0.093a 1.495±0.092a 1.423±0.113a 1.514±0.104ad

表2 低能量LED藍(lán)光對(duì)SCAPs DMEM組增殖能力的影響（OD490值，）

表2 低能量LED藍(lán)光對(duì)SCAPs DMEM組增殖能力的影響（OD490值，）

注：a與非光照組對(duì)比，P＜0.05；實(shí)驗(yàn)亞組兩兩比較：b與1 J/cm2光照能量比較，P＜0.05；c與2 J/cm2光照能量比較，P＜0.05；d與3 J/cm2光照能量比較，P ＜ 0.05

光能量密度（J/cm2） 照射天數(shù)0 1 2 3 4第1 d 0.645±0.027 0.621±0.026a 0.565±0.077ab 0.648±0.008 0.697±0.042abc第3 d 0.792±0.016 0.740±0.038a 0.765±0.049 0.663±0.088ac 0.815±0.042bd第5 d 1.453±0.033 1.514±0.122 1.498±0.065 1.500±0.127 1.617±0.082ac第7 d 1.750±0.078 1.793±0.094 1.938±0.096a 1.718±0.154c 2.158±0.172abcd第9 d 1.661±0.098 1.659±0.082 1.796±0.109a 1.708±0.066 2.147±0.136abcd

圖5 ODM組與DMEM組SCAPs的增殖變化

3 討論

研究表示SCAPs來(lái)源于早期成牙本質(zhì)細(xì)胞且對(duì)根部牙本質(zhì)的形成、牙根發(fā)育有重要作用[1,8]。SCAPs具有較高增殖、分化、促進(jìn)根尖周組織愈合能力[9]，在骨及牙組織再生方面有重要意義，有望治療多種原因引起的年輕恒牙病變。光生物調(diào)節(jié)法（photobiomodulation，PBM）是利用低能量LED藍(lán)光照射生物組織，對(duì)其細(xì)胞功能進(jìn)行調(diào)制的一種方法。在臨床上可通過(guò)選用正確的參數(shù)和適應(yīng)癥，PBM作為輔助治療，改善臨床療效[10]。LED藍(lán)光具有廣譜的抗菌作用[11]，能殺滅革蘭陽(yáng)性和革蘭陰性菌。波長(zhǎng)450～475 nm的LED藍(lán)光，臨床上被首選治療新生兒黃疸[12]?？梢?jiàn)藍(lán)光可促進(jìn)人角質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分化標(biāo)記物的增加[6]。Higuchi實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)1 mW/cm2波長(zhǎng)470 nm藍(lán)光可影響羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化[7]。光劑量范圍從0.5～10 J/cm2之間被認(rèn)為可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖[13]。光能量密度在0.5～4 J/cm2之間，刺激干細(xì)胞生長(zhǎng)方面更有效[14-17]。所以本實(shí)驗(yàn)采用420～470 nm，功率1 mW/cm2，光能量密度0～4 J/cm2的低能量LED藍(lán)光，研究LED藍(lán)光對(duì)SCAPs增殖的影響。

本實(shí)驗(yàn)獲取的原代SCAPs呈長(zhǎng)梭形、貼壁生長(zhǎng)，能夠形成細(xì)胞克隆集落，并具有自我更新能力。SCAPs間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原CD105、CD146、CD90陽(yáng)性表達(dá)和造血細(xì)胞表面標(biāo)記物CD45陰性表達(dá)，與以往根尖乳頭細(xì)胞提取中獲得的結(jié)果相同，表明SCAPs來(lái)自骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性[18-19]。MTT結(jié)果顯示整體分組趨勢(shì)傾向于“S”形曲線，說(shuō)明獲取的SCAPs處于對(duì)數(shù)期，細(xì)胞活性好，具有良好的生長(zhǎng)能力[20]。相同光能量密度下，DMEM組的增殖率高于ODM組，其原因可能是ODM組中成骨誘導(dǎo)液促進(jìn)了SCAPs的分化，抑制了增殖。與Owen TA[21]研究中礦化液抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)成骨表達(dá)這一點(diǎn)一致。相同培養(yǎng)基中，光照組與非光照組間有差異。ODM組中非光照組增殖率高于光照組，隨著時(shí)間推移，光照組增殖率明顯低于0 J/cm2，表明在礦化條件下LED藍(lán)光可抑制SCAPs的增殖，時(shí)間越長(zhǎng)，抑制效果越明顯。初步證實(shí)LED藍(lán)光與礦化培養(yǎng)基存在協(xié)同作用，有利于SCAPs的分化，這與Robertson[6]的報(bào)道結(jié)果相似。而DMEM組中光照組增殖速率高于非光照組，增值率最高為4 J/cm2，同樣隨時(shí)間增長(zhǎng)，差異越明顯，說(shuō)明LED光作為輔助工具，在普通培養(yǎng)基中可以通過(guò)光照促進(jìn)細(xì)胞的增殖。以往實(shí)驗(yàn)研究中雖然有4 J/cm光照能量的報(bào)道[22]，但是整體的光能量參數(shù)仍然參差不齊。本實(shí)驗(yàn)利用有效光能量參數(shù)0～4 J/cm2，得出在ODM組和DMEM組中，相比非光照組，光照組1～4 J/cm2的增殖率都有所改變，其中4 J/cm2改變較明顯，表明在普通培養(yǎng)基和礦化條件下4 J/cm2低能量LED藍(lán)光對(duì)SCAPs生物特性影響較大，可以更好的促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化。因此，在一定條件下可通過(guò)LED藍(lán)光影響SCAPs增殖特性，有利于SCAPs在組織工程中的發(fā)展。雖然有學(xué)者指出ATP/cAMP通路可能是調(diào)節(jié)光照射引導(dǎo)細(xì)胞增殖的機(jī)制，所以光照可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的平衡參數(shù)，如氧化還原的敏感因子的表達(dá)等導(dǎo)致細(xì)胞的增殖發(fā)生變化[23]。但是機(jī)制尚不完全統(tǒng)一，目前LED藍(lán)光對(duì)SCAPs的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了LED藍(lán)光干預(yù)下SCAPs的增殖情況，表明低能量LED藍(lán)光可影響SCAPs生物學(xué)特性。光治療可以協(xié)助干細(xì)胞工程，促使細(xì)胞大量增殖和分化，是提升組織工程和重建過(guò)程中重要的措施，在實(shí)驗(yàn)和臨床上有很大潛力和重要意義，LED藍(lán)光對(duì)SCAPs增殖、分化機(jī)制的研究需進(jìn)一步探索。