潘慶春，喻望博，李四軍

喉癌是全球常見的頭頸部惡性腫瘤，而鱗狀細(xì)胞癌是最常見的一種病理類型[1-2]。然而，喉癌被診斷時(shí)通常處于中晚期階段，并常伴有局部病灶浸潤擴(kuò)散和遠(yuǎn)處淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移[3]。盡管隨著診斷技術(shù)的進(jìn)步和治療方式的改善，總體的生存率有所提升，但仍然不盡如人意[4]?，F(xiàn)在學(xué)者們更注重對腫瘤分子特征進(jìn)行區(qū)別，并根據(jù)特定的基因組差異進(jìn)行腫瘤的亞型分類[5]。根據(jù)精確的腫瘤分類所開發(fā)出的針對精確分子改變的臨床治療稱為靶向治療[6-7]。這種治療方法為癌癥患者提供了更為有效的治療，并且與常規(guī)化學(xué)療法相比，通常具有更小的毒副作用[8]。miRNAs是一類非編碼RNA，能通過與編碼蛋白R(shí)NA的3' -UTR端結(jié)合，從而影響基因的功能與表達(dá)[9]。miRNA通過結(jié)合與之相同或相似的互補(bǔ)序列來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，引起翻譯的抑制或切割mRNA靶標(biāo)[10]。miR-133已被證實(shí)在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用[11-15]，能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和細(xì)胞周期進(jìn)展[16]。但miR-133在喉癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用尚不清楚。本研究擬探討miR-133對喉癌細(xì)胞的影響及其相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1組織標(biāo)本 選取2017年1月—2018年1月我院收治20例喉癌患者的腫瘤組織及癌旁正常組織。患者年齡37～68歲，平均52歲；病例樣本病理類型均為鱗狀細(xì)胞癌，臨床病理分期均為Ⅰ～Ⅱ期。將取下的組織樣品在液氮中快速冷凍。所有患者手術(shù)前沒有接受過放療或化療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)所有實(shí)驗(yàn)組織標(biāo)本的使用。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 人喉癌細(xì)胞株Hep-2和TU212購買于武漢大學(xué)；RPMI-1640培養(yǎng)基和0.25胰酶(0.25 Trypsin EDTA)購買于美國Gibco公司；胎牛血清和雙抗(Penicillin-Streptomycin Solution)購買于美國?？寺」?；PBS磷酸鹽緩沖液購買于BOSTER。細(xì)胞均培養(yǎng)在含10%胎牛血清和1%雙抗的培養(yǎng)基中，所有細(xì)胞均在5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)，每隔3 d換液1次，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底進(jìn)行傳代，以下所有試驗(yàn)均取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-133 mimics和miR-133 inhibitor購買于上海吉瑪有限公司。PBS緩沖液清洗Hep-2和TU212細(xì)胞，應(yīng)用胰酶消化2 min，轉(zhuǎn)移至無菌15 ml離心管，離心并計(jì)數(shù)細(xì)胞，以每孔4×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，使過夜細(xì)胞融合率達(dá)70%左右，細(xì)胞分為Hep-2 mimics組、Hep-2 NC組、Hep-2 inhibitor組、TU212 mimics和TU212 NC組，其中mimics組細(xì)胞均轉(zhuǎn)染miR-133 mimics慢病毒，inhibitor組細(xì)胞均轉(zhuǎn)染miR-133 inhibitor慢病毒，NC組細(xì)胞均轉(zhuǎn)染NC慢病毒。無血清培養(yǎng)基將Lipofectamine 2000按3 μl/L稀釋，37℃孵育20 min，用無血清培養(yǎng)基分別將miR-133 mimics和miR-133 inhibitor按50 μmol/L濃度稀釋，常溫下孵育5 min，與Lipofectamine 2000等體積分別混勻，分別加入細(xì)胞中，37℃孵育箱繼續(xù)培養(yǎng)；12 h后，觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞狀態(tài)，并將無血清培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，提取細(xì)胞RNA，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.4定量實(shí)時(shí)PCR分析 氯仿、乙醇、異丙醇購買于重慶川東化工公司；Trizol裂解液、Premix ExTaq Version2.0和SYBR Premix Ex Taq購買于日本Takara公司。PCR引物由上海Sangon Biotech公司合成。miR-133的qRT-PCR檢測以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，重復(fù)3次，利用熒光PCR儀檢測cDNA中miR-133的相對表達(dá)量，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s，45個(gè)循環(huán)，獲取熒光信號(hào)溫度為60℃。普通cDNA的qRT-PCR檢測以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，反應(yīng)條件為95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。

1.5劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 將喉癌細(xì)胞以每孔2×104個(gè)細(xì)胞密度接種于6孔板，融合度達(dá)到后，用200 μl消毒槍頭垂直劃線，并于顯微鏡下測量劃痕的初始距離，在恒溫孵箱中孵育72 h后，再次測量劃痕的距離，并計(jì)算細(xì)胞的遷移率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6Transwell侵襲試驗(yàn) Transwell基質(zhì)膠購買于美國BD公司；Transwell小室購買于美國康寧公司。將5×104個(gè)細(xì)胞置于上室，并加入Matrigel基質(zhì)膠。將含10%胎牛血清和HGF(20 μg/ml)的培養(yǎng)基置于下室。37℃孵育24 h，去除上膜表面的細(xì)胞。95%乙醇固定20 min，0.5%結(jié)晶紫溶液染色10 min，自來水沖洗后，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.7熒光素酶報(bào)告基因測定 構(gòu)建含成纖維細(xì)胞生長因子受體1(FGFR1)基因野生型3'-UTR(含miR-133識(shí)別位點(diǎn)/wt)和突變型3'-UTR(miR-133識(shí)別位點(diǎn)點(diǎn)突變/mut)片段，兩端均設(shè)計(jì)XbaⅠ酶切位點(diǎn)，插入熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒構(gòu)建pGL3-3'-UTR wt、pGL3-3'-UTR mut。取生長狀態(tài)良好的喉癌Hep-2細(xì)胞，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h據(jù)操作說明，裂解細(xì)胞，加入熒光素酶底物，檢測熒光素酶活性，以證明miR-133直接調(diào)控PRDX1。

1.8Western blotting實(shí)驗(yàn) GAPDH小鼠抗人一抗、β-actin小鼠抗人一抗購買于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；Western blotting凝膠試劑盒和全蛋白提取試劑盒購買于碧云天公司；ECL發(fā)光液購買于索萊寶生物科技有限公司。根據(jù)蛋白分子量大小，配制凝膠，根據(jù)所測蛋白濃度加入蛋白樣品以及每孔5 μl蛋白marker；跑膠，首先加壓80 V，保證所有樣品在同一水平線，待樣品至分離膠處，將電壓加到120 V；切膠，根據(jù)所需條帶大小，對照蛋白marker進(jìn)行切膠，并準(zhǔn)備與所切膠條相同大小濾紙2片和PVDF膜(浸泡甲醇15 s)；按照濾紙、膠、PVDF膜、濾紙的順序按序排好，并趕出氣泡，壓緊，在250 mA恒流下，按1 kD蛋白1 min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，PBST洗膜1次，脫脂奶粉封閉1 h；PBST洗膜1次，將膜浸入稀釋好的一抗中，4℃過夜；PBST洗膜3次，將膜浸入稀釋好的二抗中，常溫下孵育1 h；顯影，PBST洗膜3次后，在暗室中曝光，并分析。

2 結(jié)果

2.1miR-133的表達(dá)情況 miR-133在喉癌組織和癌旁正常組織的表達(dá)分別為0.57±0.12和1.09±0.02。與癌旁正常組織比較，喉癌組織中miR-133呈顯著低表達(dá)狀態(tài)(P<0.05)。

2.2miR-133對Hep-2和TU212細(xì)胞遷移的影響 Hep-2 mimics組和Hep-2 NC組的細(xì)胞的遷移率分別為(40.1±10.4)%和(98.4±9.5)%，TU212 mimics組和TU212 NC組的細(xì)胞的遷移率分別為(58.6±8.0)%和(99.2±10.1)%。與Hep-2 NC組和TU212 NC組比較，Hep-2 mimics組和TU212 mimics組的細(xì)胞遷移率均顯著降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 miR-133對人喉癌Hep-2和TU212細(xì)胞遷移的影響

2.3miR-133對Hep-2和TU212細(xì)胞侵襲的影響 Hep-2 NC組和Hep-2 mimics組細(xì)胞侵襲率分別為(98.4±7.5)%和(48.1±10.4)%，TU212 NC組和TU212 mimics組細(xì)胞侵襲率分別為(97.2±10.1)%和(38.2±5.3)%。與Hep-2 NC組和TU212 NC組比較，Hep-2 mimics組和TU212 mimics組的細(xì)胞侵襲率顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 miR-133對人喉癌Hep-2和TU212細(xì)胞侵襲的影響

2.4miR-133靶向調(diào)控FGFR1 通過Targetscan網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)miR-133與FGFR1具有相似的結(jié)合位點(diǎn)。見圖3。通過雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證二者的關(guān)系，結(jié)果顯示野生型和突變型FGFR1基因的熒光素酶活性分別為0.26±0.02和0.96±0.06，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明miR-133可以明顯抑制野生型FGFR1基因的熒光素酶活性，而對突變型FGFR1基因的熒光素酶活性無影響。Western blotting結(jié)果也表明，Hep-2 mimics組、Hep-2 inhibitor組和Hep-2 NC組FGFR1蛋白表達(dá)分別為(31.8±8.0)%、(96.1±9.6)%和(73.2±6.8)%，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-133的過表達(dá)和沉默能使Hep-2細(xì)胞中的FGFR1蛋白表達(dá)量下調(diào)和上調(diào)。見圖4。

圖3 FGFR1基因與miR-133的3'-UTR基因序列比對FGFR1為纖維細(xì)胞生長因子受體1

圖4 miR-133對Hep-2細(xì)胞FGFR1蛋白表達(dá)的影響FGFR1為纖維細(xì)胞生長因子受體1

3 結(jié)論

喉癌患者存在miRNAs的失調(diào)，有研究顯示，miRNAs在喉癌的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲和凋亡過程中發(fā)揮重要作用[17]。miRNAs在喉癌中可以發(fā)揮致癌作用或抑癌作用[18]。Cao等[19]通過研究發(fā)現(xiàn)，共有26個(gè)miRNAs在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，有3個(gè)miRNAs顯著低表達(dá)，而且還發(fā)現(xiàn)，miR-21、miR-93、miR-205和miR-708是顯著上調(diào)的，而miR-125b和miR-145顯著下調(diào)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，喉癌組織中miR-133呈顯著低表達(dá)狀態(tài)。表明miR-133在喉癌中可能是扮演抑癌基因的角色。

不同miRNAs對喉癌細(xì)胞的影響可能通過不同的行為方式及相應(yīng)的機(jī)制。如miR-1通過直接影響纖維連接蛋白1的途徑抑制Hep-2細(xì)胞的生長、遷移和侵襲[20]。Guo等[21]研究發(fā)現(xiàn)，miR-24通過下調(diào)S100A8誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞形態(tài)改變并抑制細(xì)胞增殖和侵襲。另外，miR-30b參與調(diào)節(jié)重要的腫瘤抑制基因p53，在miR-30b過表達(dá)的Hep-2細(xì)胞中p53表達(dá)顯著增強(qiáng)，同時(shí)miR-30b過表達(dá)增加p53介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡[22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Hep-2 NC組和TU212 NC組比較，Hep-2 mimics組和TU212 mimics組細(xì)胞的侵襲率和遷移率顯著降低。表明miR-133的過表達(dá)能顯著抑制Hep-2和TU212細(xì)胞的增殖和遷移能力。

成纖維細(xì)胞生長因子受體(FGFRs)是一種酪氨酸激酶，位于染色體8p12上，與多種腫瘤侵襲行為密切相關(guān)，而且能一定程度上預(yù)測患者的生存和預(yù)后[23-24]。FGFRs家族包括酪氨酸激酶的亞組受體，由5個(gè)結(jié)構(gòu)保守的反式膜糖蛋白組成，含有3個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域在其胞外區(qū)[25]。被認(rèn)為是真正的致癌基因，可能在腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[26]。FGFRs及其配體，即成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，參與多種正常生物學(xué)進(jìn)程，包括細(xì)胞分化、增殖、遷移和血管生成等[27]。大量證據(jù)還表明，F(xiàn)GF-FGFR途徑在腫瘤發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用，并可能促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并激活關(guān)鍵的致癌信號(hào)通路，包括PI3K/AKT，RAS/MAPK和TGFβ途徑[28]。

FGFR1的高表達(dá)也在頭頸部的惡性腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，而且其上調(diào)多見于人乳頭狀瘤病毒陰性鱗癌[29]。與肺癌類似，F(xiàn)GFR1的升高預(yù)示著喉癌患者生存率的降低[30]。目前，對喉癌尚無針對FGFR1的靶向治療。本研究通過Targetscan網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)，miR-133與FGFR1具有相似的結(jié)合位點(diǎn)，兩者可能有內(nèi)在調(diào)控關(guān)聯(lián)。本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-133可以明顯抑制野生型FGFR1基因的熒光素酶活性，而對突變型FGFR1基因的熒光素酶活性無影響。表明miR-133可以與FGFR1的3'-UTR特異性結(jié)合。同時(shí)miR-133的過表達(dá)和沉默能使Hep-2細(xì)胞中的FGFR1蛋白表達(dá)量下調(diào)和上調(diào)。以上結(jié)果均證實(shí)miR-133能靶向調(diào)控FGFR1的表達(dá)，從而進(jìn)一步影響腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)進(jìn)程。

綜上所述，miR-133能通過靶向調(diào)控FGFR1蛋白的表達(dá)從而影響喉癌細(xì)胞遷移和侵襲能力。miR-133可能會(huì)成為治療喉癌的新的靶點(diǎn)。