張嵩元，邱建輝，王宣，董一名，李昱龍，張益豪，歐陽頎

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基于重組酶和終止子的狀態(tài)調控開關設計

張嵩元1*，邱建輝1*，王宣2，董一名1，李昱龍1，張益豪1，歐陽頎1

1 北京大學 定量生物學中心與生命科學聯(lián)合中心，北京 100871 2 清華大學 生命科學學院與生命科學聯(lián)合中心，北京 100084

張嵩元, 邱建輝, 王宣, 等. 基于重組酶和終止子的狀態(tài)調控開關設計. 生物工程學報, 2018, 34(12): 1874–1885.Zhang SY, Qiu JH, Wang X, et al. Design of recombinase and terminator-based genetic switches for cell state control. Chin J Biotech, 2018, 34(12): 1874–1885.

合成生物學研究常用基因開關來調控細胞的狀態(tài)以實現(xiàn)相應功能。已有的基因開關往往需要持續(xù)的輸入信號來維持特定的開關狀態(tài)，開關功能的維持需要持續(xù)消耗能量，并且對擾動較為敏感。文中利用了位點特異性重組酶的倒位效應反轉終止子，構建了一種轉錄層次的狀態(tài)調控開關，使得脈沖信號即可觸發(fā)開關狀態(tài)改變，并在下一次信號來臨前穩(wěn)定維持當前狀態(tài)。應用自下而上的工程化思想，文中先后對重組酶和終止子進行了單獨表征和組合表征，探究了二者之間的相互影響，篩選出了相互兼容的組合，成功實現(xiàn)了細胞的單次、二次狀態(tài)切換。最后，此開關成功地被用于構建生物七段譯碼器，顯示出了其較好的應用潛力。

位點特異性重組酶，終止子，調控開關，狀態(tài)轉換

生命體中發(fā)生的許多生物過程都可以抽象為“開關” (Switch)[1]。如細胞分化時，某些外界信號觸發(fā)“分化開關”，使得干細胞基因選擇性表達以執(zhí)行特定功能。正常情況下，這種狀態(tài)切換是非常穩(wěn)定的。一旦發(fā)生，即使分化信號不再存在，細胞的狀態(tài)也不容易被逆轉，除非再次接受一組特定脫分化信號的刺激。一些構象可改變的蛋白也具有“開關”的性質，如光受體蛋白[2]、壓力[3]/電壓[4]/配體[5]門控離子的通道蛋白等。當外界信號(光、小分子物質、電位差) 存在時，蛋白被活化以執(zhí)行功能，當外界信號不復存在時蛋白立即變?yōu)槭Щ顮顟B(tài)。

目前在合成生物學領域，多種自然或人工的“開關”已經投入生物學應用中，如誘導型啟動 子[6]、光敏離子通道[7-8]、Toehold Switch[9]等。這些開關大多需要輸入信號的維持才可保持在開啟狀態(tài)，這個過程會不斷地消耗能量，狀態(tài)維持往往依賴于細胞內蛋白、核酸分子等的濃度維持在某一平衡濃度，外界干擾諸如細胞分裂，細胞缺乏營養(yǎng)等很容易打破平衡，雖然這些開關已經用于多種場景，但它們難以像細胞分化那樣進行穩(wěn)定的、自身可持續(xù)的狀態(tài)切換。

上述依賴外界信號維持狀態(tài)的“開關”具有一個共同特點——狀態(tài)切換對應著生物大分子結構變化。我們可以想象，當生物大分子的序列而不是結構發(fā)生變化時，尤其是DNA序列發(fā)生變化時，“開關”造成的狀態(tài)切換將是穩(wěn)定的且是可自我維持的。

位點特異性重組酶 (Site-specific recombinases，SSRs) 介導的重組反應被廣泛用于遺傳工程操作中來改變DNA序列，如著名的Cre/LoxP和Flp/FRT基因敲除系統(tǒng)。SSRs具有一對特異的識別位點 (Recognition site)——attB位點和attP位點。根據重組位點的序列和排列的方向性，位點特異性重組有3種可能的結果，即整合(Integration)、切離(Excision) 和倒位(Inversion)，如圖1所示，當兩位點反向位于同一DNA上時，將產生倒位生成attL位點和attR位點[11]。位點特異性重組系統(tǒng)可分為兩類：酪氨酸重組酶(Tyrosine recombinase) 和絲氨酸重組酶(Serine recombinase)，后者中的大絲氨酸重組酶亞家族的識別位點簡單且高度特異，且反應方向控制嚴 格——只有當重組定向性因子(Recombination directionality factor，RDF) 存在時才能識別attL與attR序列，逆轉上述反應重新生成attB、attP位點[12]。

除了傳統(tǒng)的基因敲除，Timothy K. Lu研究團隊利用重組酶整合單鏈DNA進入基因組[13]或直接翻轉DNA序列[14]成功開發(fā)了多種DNA存儲器，使細胞以DNA序列為載體“記錄”外界事件。在醫(yī)療領域中，研究者通過在腸道益生菌中構建這種存儲器，可以實現(xiàn)對腸道環(huán)境的檢測[15]。研究者可利用重組酶翻轉啟動子、終止子、編碼序列等有功能基因元件構建新型邏輯線路，使細胞能夠對外界信息產生更復雜的響應模式[14,16-17]。在此過程中一系列具有良好正交性的重組酶被篩選出來，如大絲氨酸重組酶亞家族的phiC31、Bxb1、TP901-1和酪氨酸家族的Int系列等[18]。

終止子是合成生物學中重要的元件，可用于終止轉錄、基因線路間的絕緣等。以其是否依賴于ρ因子可以分為兩類：依賴ρ因子的終止子需要額外的ρ因子終止轉錄[19]，不依賴ρ因子的終止子可利用自身形成莖環(huán)結構及polyU序列終止轉錄過程[20]。此外，根據是否在兩個轉錄方向上均具有轉錄終止能力可分為雙向(Bidirectional)終止子[21]和單向(Unidirectional) 終止子。2013年Chen等報道了其表征的來自大腸桿菌的和人工設計的共計582個終止子的元件庫[22]，我們可以從這個庫中挑選適合的終止子用于轉錄調控開關的設計。

圖1 當兩個識別位點排列方式不同時重組酶表現(xiàn)插入/刪除/翻轉效應

在本研究中，我們利用位點特異性重組酶的倒位效應翻轉終止子，構建了一種穩(wěn)定的轉錄狀態(tài)調控開關。首先我們單獨表征了終止子和重組酶的性能：通過測試正向反向接入時的轉錄終止能力從終止子庫中篩選出單向強終止子；通過測試重組酶的翻轉效率得到最優(yōu)的重組酶-RBS-誘導物濃度組合。然后我們分別將一對、兩對重組酶識別序列引入終止子兩側。考慮識別序列與終止子的互相影響，我們再次測試了轉錄終止能力，篩選并表征了多組兼容的組合。接著，使用相應的重組酶作用于這些組合成功地實現(xiàn)了“開關”功能，并表征了此系統(tǒng)的性能。最后，通過組合上述開關制成了“生物七段譯碼器”，實現(xiàn)了數字顯示圖像的切換。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

TOP10，購自北京博邁德基因技術有限公司。

pTAC-pSB4C5 (pSC101 ori，repA，CmR，lacⅠ，pTAC，RiboJ，sfGFP)，由pSB4C5質粒(parts.igem. org/Part:pSB4C5)改造而成，IPTG誘導后可表達增強型綠色熒光蛋白。RiboJ作為絕緣子防止RBS上游非翻譯區(qū)對翻譯的影響[23]。啟動子和RBS間可連入終止子及重組酶識別位點，用于表征終止子性能，或作為重組酶的作用靶標，以實現(xiàn)狀態(tài)切換的開關功能，作為“報告質?！保４嬗诒緦嶒炇?。

pBAD誘導表達質粒(ColE1 ori，KanR，AraC，pBAD，RBS，Recombinase)，作為“表達系統(tǒng)”在阿拉伯糖誘導下表達重組酶，為狀態(tài)切換提供驅動力。RBS序列插入位點兩端含一對BⅠ位點，用于更換RBS以探尋最適重組酶表達量。保存于本實驗室。

pTAC誘導表達質粒(p15A ori，AmpR，LacI，pTAC，RBS，Recombinase)，在IPTG誘導下表達重組酶，功能與pBAD誘導表達載體相同。保存于本實驗室。

重組酶測試質粒(pSC101 ori，CmR，RFP，attB，pTAC，GFP)，用來表征重組酶效率。包含一個可以被翻轉的pTAC啟動子，翻轉前后分別表達綠色、紅色熒光蛋白。保存于本實驗室。

1.1.2 主要試劑

LB培養(yǎng)基與M9培養(yǎng)基。質粒小提試劑盒(康寧生命科學(吳江) 有限公司)。膠回收試劑盒(天根生化科技(北京) 有限公司)。2×EasyPCR SuperMix (北京全式金生物技術有限公司)。T4 DNA連接酶和限制性內切酶RⅠ、Ⅰ、Ⅰ、Ⅰ，BⅠ(NEB)。誘導物：IPTG、阿拉伯糖。

1.2 方法

1.2.1 終止子性能的表征

初步選擇：我們根據已有的對自然及人工終止子的表征數據[22]初步選擇一些具有較強轉錄終止能力的終止子進行進一步測試。

質粒構建：終止子性能表征的基因線路如圖2A所示。利用先合成單鏈寡核苷酸再退火的方法得到一雙鏈DNA片段，其兩端含有Ⅰ位點，中間是一段隨機序列的雙鏈DNA片段。該序列與普通終止子長度相似(50 bp)，含50%GC，已證明對轉錄無影響[14]。利用RⅠ、Ⅰ雙酶切pTAC-pSB4C5質粒并膠回收，連入上述短片段。得到的質粒可以利用Golden Gate assembly 法一步快速替換隨機序列為各種終止子。同時，由于此處隨機序列可認為不影響轉錄，故此質?？勺鳛榻K止子表征時的陽性對照。對于每一個候選終止子，利用先合成單鏈寡核苷酸再退火的方法，分別得到其正向(Forward，F(xiàn)) 與反向(Reverse，R) 雙鏈DNA片段(規(guī)定正向為其在生物體中自然存在方向或能發(fā)揮轉錄終止功能的方向)。該片段中，終止子序列兩端設計有Ⅰ酶切位點。利用Golden Gate assembly法將片段插入前述質粒中。分別在誘導型啟動子后與sfGFP上設計引物，菌落PCR后測序檢測是否成功連入。

誘導培養(yǎng)：挑平板菌落于含抗生素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。取培養(yǎng)物1∶100稀釋于深孔板中，37 ℃、1 500 r/min培養(yǎng)2 h。取少量培養(yǎng)物用含抗生素的 M9培養(yǎng)基1∶100稀釋于另一深孔板中，加入IPTG設置終濃度為0.01 mmol/L、0.1 mmol/L和1 mmol/L，同上條件培養(yǎng)6 h。取少量培養(yǎng)物用含2 mg/mL卡那霉素或35 μg/mL氯霉素的PBS緩沖液1∶5稀釋于96孔板中，以抑制蛋白質生成?？瞻讓φ战M為不轉上述質粒并經過相同培養(yǎng)步驟的.TOP10。

流式細胞儀檢測：用流式細胞儀(BD LSRFortessa?) 的488 nm激發(fā)光檢測細胞的綠色熒光強度，設置進樣體積(Injection volumn) 為15 μL，流速(Flow rate) 為1 μL/s，每孔樣品最小樣本量為10 000個細胞。流式數據用FlowJo?軟件分析得到熒光強度平均值。

表征：各組樣品平均值減去通過空白對照組測得的本底熒光，得到凈熒光強度。定義終止子強度(Terminator strength，Ts) 為陽性對照(含不阻止轉錄的隨機序列)的熒光強度([GFP]random) 與實驗組(含終止子) 熒光強度([GFP]ter) 的比值。

該值越大表明終止子的轉錄終止能力越強。若 反向接入時該值小于1說明終止子是個潛在的啟動子[24] (Cryptic promoter)。通過計算每一終止子的正 向與反向Ts的比值來驗證終止子是否為單向的(Unidirectional)，該值越大說明終止子正反向接入的作用差異越大，更具有“開關”的性質?；谝陨蟽蓚€計算值，我們制定了終止子的篩選標準：正反向的Ts值均大于0.9 (沒有潛在啟動子)；正反向Ts比值大 于10 (ON、OFF狀態(tài)差異足夠明顯)；正反向中較 大的Ts大于10(OFF狀態(tài)時基因表達受嚴格抑制)；正反向中較小的Ts不大于1.2 (ON狀態(tài)時基因表達 基本不被抑制)。滿足標準的終止子進入下一步篩選。

1.2.2 重組酶翻轉效率的表征及表達系統(tǒng)的改進

我們從RBS Calculator[25]和iGEM元件庫中得到了一系列RBS序列，先合成單鏈寡核苷酸再退火得到雙鏈DNA。利用Golden Gate assembly法更換RBS序列，構建不同表達強度的pBAD誘導的Bxb1、phiC31重組酶表達質粒和pTAC誘導的TP901-1、Int2重組酶表達質粒。將其與重組酶測試質粒共轉入.TOP10中以構建重組酶效率測試體系(圖3A)。在雙抗平板上挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37 ℃、1 000 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。取2 μL菌液加入含抗生素和不同濃度誘導物(0、10–5、10–4、10–3、10–2、10–1、100、101、102mmol/L)的M9培養(yǎng)基中，深孔板37 ℃、1 000 r/min誘導培養(yǎng)15 h。取2 μL培養(yǎng)物加入198 μL PBS中，用流式細胞儀測量誘導結果，通過統(tǒng)計細菌表型可以看到是否發(fā)生翻轉，利用FlowJo?軟件分析可得重組酶效率。

1.2.3 終止子兩側引入一對重組酶識別位點

終止子的轉錄終止能力依賴RNA形成的莖環(huán)結構?？紤]到重組酶識別序列會同樣具有特殊構象，這不但會影響終止子功能，其本身也會對轉錄造成一定影響，我們進行了第二輪篩選，以得到互相兼容的識別位點-終止子組合，基因線路如圖2B所示。

圖3 重組酶翻轉效率與表達系統(tǒng)的優(yōu)化

質粒構建：以1.2.1中pTAC-pSB4C5的酶切膠回收產物為載體，酶切連接法連入一短片段，得到的質?？梢宰鳛椴迦胫亟M酶識別位點以及終止子的載體。為了方便高通量構建，我們在兩個重組酶識別序列插入位點兩端各設計了一對BⅠ切割位點，終止子兩端設計了一對Ⅰ切割位點，這樣就可以用Golden Gate assembly法一步高效替換重組酶識別序列和終止子，形成不同組合。重組酶識別位點信息通過單鏈退火的方法得到(序列請見2017.igem.org/Team:Peking)。其余構建、檢驗步驟同1.2.1。陽性對照組含有某重組酶識別序列但終止子以隨機序列替代。誘導培養(yǎng)步驟與1.2.1相同。

酶標儀檢測：我們采用酶標儀(Thermo Scientific Varioskan?Flash) 粗測樣品的熒光強度(激發(fā)波長485 nm、510 nm發(fā)射波長) 與值，取二者比值則為單位數量細菌的相對熒光強度。與1.2.1中的單細胞平均熒光強度具有相同統(tǒng)計意義。公示表征步驟同1.2.1。篩選得到表現(xiàn)良好的組合做進一步篩選。

1.2.4 終止子兩側引入兩對重組酶識別位點

產生多種狀態(tài)需要重組酶的多次作用，故需要多對重組酶識別位點。兩對識別位點將對終止子的開關性能產生更大影響，故需要進一步表征篩選。含兩對識別位點的報告質粒如圖2C所示。

質粒構建：將pTAC-pSB4C5的誘導型啟動子刪除，更換為組成型表達的J23119啟動子。合成一段雙鏈DNA片段連入該質粒。該片段含兩對嵌套的重組酶位點與一個終止子。外側的重組酶位點固定為一表征較好的高效重組酶，內側位點及終止子按1.2.2設計并可以更換。誘導培養(yǎng)、酶標儀檢測、公式表征步驟同1.2.2。

1.2.5 重組酶翻轉終止子性能表征

兩次翻轉：將報告質粒與對應的兩個重組酶表達質粒共轉入.TOP10中，三抗平板上培養(yǎng)。其他步驟同一次翻轉。

1.2.6 演示：七段譯碼器三狀態(tài)轉換

由1.2.3和1.2.5的實驗，我們得到了基于重組酶翻轉作用和終止子的基因“開關”。當終止子兩側引入兩對識別位點時，意味著可以通過控制兩種重組酶表達，對終止子進行兩次翻轉。算上初始狀態(tài)，該開關可以產生3個狀態(tài)(即“開-關-開”或“關-開-關”)。

電子器件中常見的七段譯碼器示數變化“1-2-3”可作為上述過程的形象演示。如圖5A所示，利用1.1.1–1.2.5的材料與方法我們可以在96孔板上實現(xiàn)“生物基的七段譯碼器”?？紤]每個顯示管的明暗變化順序，7個顯示管有5種狀態(tài)轉換模式(000、111、011、010、101，0、1分別代表暗、亮)，因此要使用5種報告質粒與重組酶表達質粒的組合。每次手動狀態(tài)切換時，將上一狀態(tài)的菌液1∶100稀釋于含相應抗生素和誘導物(依次10 mmol/L阿拉伯糖、0.1 mmol/L IPTG) 的M9培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12 h得到后一狀態(tài)。誘導結束后依據1.2.2中方法得到單位數量細菌的熒光強度，并在藍光板上對其拍照。

2 結果與分析

2.1 終止子性能的表征

共選取24個已報道的強力終止子納入我們的系統(tǒng)中進行表征(序列請見2017.igen.org/Team:Peking)。

比較4個IPTG濃度梯度下的Ts，我們發(fā)現(xiàn)隨誘導物濃度加大，對于具有較強轉錄終止能力的終止子方向，其Ts總體呈現(xiàn)先迅速上升后略微下降的趨勢。若某一方向轉錄終止能力弱，變化趨勢則不明顯(圖2D嵌入圖以強力終止子435的Ts隨誘導物濃度變化的趨勢為例)。同時我們發(fā)現(xiàn)高濃度誘導物會對細胞產生一定代謝負擔和毒性，故選擇0.1 mmol/L IPTG為最終誘導濃度。24個終止子依據其正反向Ts可分為單向終止子與雙向終止子(圖2D)。我們最終得到了6個符合前述4條標準的終止子(435、322、309、221、836、855)，其中435表現(xiàn)最佳，正向Ts高于1 000，反向Ts接近1，是典型的單向強終止子。

2.2 重組酶翻轉效率的表征及表達系統(tǒng)改進

我們所應用的RBS來源于RBS calculator[25]和iGEM網站(序列請見2017.igem.org/Team:Peking，純數字代號的來自RBS calculator，“B00XX”來自iGEM Parts，“字母+數字”由B0034突變獲得)。圖3B顯示測試質粒被重組酶翻轉前后流式細胞儀的測試結果，橫軸為紅色熒光強度，縱軸為綠色熒光強度。翻轉前細胞位于對角線以上，主要表達GFP，翻轉后細胞位于對角線下，主要表達RFP。我們把誘導表達重組酶后對角線下的細胞比例定義為重組酶效率。重組酶和phiC31利用各個RBS在不同阿拉伯糖誘導濃度下的效率如圖3C所示。我們發(fā)現(xiàn)在不加誘導物時均有一定程度泄露表 達，低濃度誘導物時重組酶效率變化不大，但在10 mmol/L時效率有一個階躍式上升，最高可達90%左右。IPTG誘導也有類似的結果。因此選擇10 mmol/L阿拉伯糖和0.1 mmol/L IPTG作為最 適誘導濃度。進而測試了各重組酶在最適誘導濃度下應用不同RBS時的效率(圖3D)，最終選擇878、1 668、A6分別作為Bxb1、TP901-1、phiC31的RBS，因為其泄露較低，最適誘導濃度時效率較高。

2.3 終止子兩側引入一對重組酶識別位點

單獨的重組酶位點也會對轉錄造成一定影響，可被視為“終止子”。測試的重組酶位點中，Int2有最強的“終止子”效應(Ts=23.0)，甚至強于221F (Ts=16.6)。其他較為微弱：phiC31 (Ts=2.00)、TP901-1 (Ts=1.42)。

共測試了14個重組酶位點+終止子組合的Ts值(圖2E)。編號phiC31 435代表終止子ECK120034435兩側有重組酶phiC31的識別序列，其他以此類推。在所有組合中，int2 221擁有最強的轉錄終止效應(Ts=35.3)。滿足標準的其他組合依次為phiC31 435 (28.3)、Bxb1 435 (21.1)、TP901-1 221 (17.7)、TP901-1 435 (17.3)、int2 855 (17.2)。

值得注意的是，重組酶識別序列與終止子的Ts并非為線性疊加關系。例如，int2與435F在識別序列與終止子中各自具有最大的Ts值，但是二者組合的Ts值在所有組合中最弱(Ts=5.37)。TP901-1與221F在識別序列與終止子中各自具有最小的Ts值，但是二者組合在一起效果則很強。此外，二者的組合可能在序列內部形成啟動子，比如TP901-1 221R。

考慮到int2與TP901-1的重組酶表達質粒的啟動子為pTAC，較pBAD泄露較大。我們選擇Bxb1 435與phiC31 435進行1.2.5中的一次翻轉測試。

2.4 終止子兩側引入兩對重組酶識別位點

我們選取了翻轉效果較穩(wěn)定的重組酶Bxb1、 phiC31、TP901-1的識別位點，與終止轉錄效果最好的單向強終止子435組合在一起進行性能表征，結果如圖2F所示。最終，我們選取了性能最好的組合結構“Bxb1 attB-TP901-1 attB-435- TP901-1 attP-Bxb1 attP”和“Bxb1 attB-phiC31 attB-435-phiC31 attP-Bxb1 attP”進行1.2.5中的兩次翻轉實驗。之后將其分別簡稱為Bxb1 TP901-1 435和Bxb1 phiC31 435。

2.5 重組酶翻轉終止子性能表征

將報告質粒Bxb1 435和phiC31 435與相應的pBAD誘導表達質粒共轉進行了重組酶一次翻轉終止子的實驗(圖4A)。計算結果(圖4C)顯示有些翻轉效率 (Inversion efficiency)超過100%，有些則不足50%，與2.2.3中理想值偏差較大。經過分析，可能存在如下原因：第一，attB-F-attP經過翻轉得到attL-R-attR，而不是我們計算inversion efficiency所使用的attB-R-attP的理想狀態(tài)；第二，重組酶作用于pTAC-pSB4C5質粒翻轉終止子的效率與2.2.2中重組酶作用于重組酶測試質粒翻轉啟動子的效率存在不同，可能是終止子影響識別位點的空間結構，造成翻轉效率的變化。

兩次翻轉使用報告質粒Bxb1 TP901-1 435和Bxb1 phiC31 435及其對應的重組酶表達質粒(圖4B)，得到的結果如圖4D所示。

2.6 演示：七段譯碼器三狀態(tài)轉換

依照1.2.6我們得到了圖5B所示的結果。每個加樣孔中的數字代表單位的熒光強度。單憑肉眼可以觀察到較為明顯的狀態(tài)變化，數字圖案清晰可辨，視覺上成功實現(xiàn)了生物七段譯碼器。數據上若以50作為定義開關狀態(tài)轉換的閾值，亦可判定實驗的成功。

圖4 重組酶翻轉終止子的效率

圖5 生物七段譯碼器

3 結論

本研究通過組合重組酶識別位點和終止子構建了一種穩(wěn)定可維持的轉錄調控開關。該開關可以作為一個組件，模塊化地應用于基因線路構建中，使細胞可以感受短暫的脈沖信號從而改變自身狀態(tài)。通過細致的表征，我們發(fā)現(xiàn)了重組酶識別位點和終止子之間的相互影響是開關設計的一個瓶頸，從而揭示了此類開關的重要設計原則——尋找相互影響較小的終止子和識別位點，為大規(guī)模設計此類開關提供了一種思路。

我們通過依次表達兩個重組酶作用于終止子兩側的兩對識別位點，實現(xiàn)了兩次狀態(tài)切換。已有研究表明當重組定向性因子(Recombination directionality factor，RDF)存在時，重組酶可識別attL與attR序列發(fā)生重組反應，重新生成attB、attP位點。因此，本開關的一種優(yōu)化方式是引入RDF，使得只需要一種重組酶、一對識別位點便可實現(xiàn)兩次狀態(tài)轉換。這將避免多對識別位點對終止子的影響，提高本開關的性能。

如果要使這種狀態(tài)轉換自動化，創(chuàng)造更復雜的基因線路，可以在此系統(tǒng)中引入“計時器”。例如利用基于三因子負反饋的生物振蕩器[26]節(jié)律表達重組酶及其RDF，作用于經過設計的含此類開關的基因線路，理論上可以實現(xiàn)循環(huán)的狀態(tài)轉換過程。

此外，本研究具有較大的應用價值。工業(yè)上，可以利用此類狀態(tài)開關可設計的次序性，讓一種工程菌在發(fā)酵罐中依次合成不同產物，例如含有多種單體的高分子化合物的生物合成。醫(yī)療上，可以設計一種含此種開關的益生菌，使之在患者體內在合適的時間按一定次序給藥?；A研究中，此類開關能夠為通過“建物致知”的策略為研究細胞周期與生物節(jié)律提供新的思路和方法。

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團隊簡介：

2017年北京大學iGEM團隊由來自生命科學學院、信息科學技術學院、醫(yī)學部共13名在校本科生組成。北大iGEM團隊提出了一套在細菌內搭建遺傳時序邏輯線路，使其能夠自動按順序執(zhí)行對應功能的設計框架，充分借鑒了數字理論中時序邏輯概念，在生物系統(tǒng)中構建時鐘 (Clock)、分頻器 (Frequency Divider)、解釋器 (Interpreter) 三個基本模塊。基于重組酶和終止子元件所實現(xiàn)的細胞狀態(tài)調控便是其核心內容之一。北大iGEM團隊在2017年iGEM大賽中獲得了最佳信息處理項目獎提名 (Nominated Best Information Processing Project)，并獲得金牌。

(本文責編 郝麗芳)

Design of recombinase and terminator-based genetic switches for cell state control

Songyuan Zhang1*, Jianhui Qiu1*, Xuan Wang2, Yiming Dong1, Yulong Li1, Yihao Zhang1, and Qi Ouyang1

1 Center for Quantitative Biology and Center for Life Sciences, Peking University, Beijing 100871, China 2 Center for Life Sciences, Tsinghua-Peking Center for Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China

Various genetic switches have been developed to let engineered cells perform designed functions. However, a sustained input is often needed to maintain the on/off state, which is energy-consuming and sensitive to perturbation. Therefore, we developed a set of transcriptional switches for cell states control that were constructed by the inversion effect of site-specific recombinases on terminators. Such a switch could respond to a pulse signal and maintain the new state by itself until the next input. With a bottom-up design principle, we first characterized the terminators and recombinases. Then the mutual interference was studied to select compatible pairs, which were used to achieve one-time and two-time state transitions. Finally, we constructed a biological seven-segment display as a demonstration to prove such switch’s immense potential for application.

site-specific recombinase, terminator, genetic switch, state transition

June 30, 2018;

October 22, 2018

Talent Training Program, Educational and Teaching Reform Project of Central College.

Yihao Zhang. Tel/Fax: +86-10-62744020; E-mail: yihaozhang@pku.edu.cn

Qi Ouyang. Tel/Fax: +86-10-62744020; E-mail: qi@pku.edu.cn

10.13345/j.cjb.180270

*These authors contributed equally to this study.

中央高校教育教學改革拔尖人才培養(yǎng)項目資助。