柴慈曼，楊紹時(shí)

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，天津 300211）

根據(jù)《2015年中國腫瘤登記年報(bào)》，乳腺癌在我國女性惡性腫瘤中高居榜首，占女性癌癥總?cè)藬?shù)的15%，且發(fā)病率逐年遞增，2015年我國新發(fā)乳腺癌27.24萬人，死亡7.07萬人[1]。根據(jù)乳腺癌分子分型，約70%是雌激素受體（ER）和或孕激素受體（PR）陽性型，腫瘤生長具有雌激素依賴性[2]。對于這類患者，阻斷雌激素相關(guān)通路的內(nèi)分泌治療是經(jīng)濟(jì)、有效、低毒性的治療方法，也是目前國內(nèi)外乳腺癌診治指南中的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，臨床上他莫昔芬作為乳腺癌內(nèi)分泌治療的經(jīng)典藥物，在治療過程中常發(fā)生耐藥現(xiàn)象，約40%的ER陽性乳腺癌患者初始治療即對他莫昔芬不敏感（即原發(fā)性耐藥），另有約25%的患者初始治療有效，長期用藥后出現(xiàn)耐藥（即獲得性耐藥）[3]。目前對于他莫昔芬治療出現(xiàn)耐藥而發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的病人并沒有針對性的治療方法。雖然對此問題的研究逐年增多[4-5],但目前仍然缺乏確切有效的治療靶點(diǎn)。本研究利用Gene Expression Omnibus（GEO）公共數(shù)據(jù)庫提取ER陽性乳腺癌mRNA表達(dá)譜芯片測序數(shù)據(jù)，應(yīng)用生物信息學(xué)方法，篩選ER陽性型乳腺癌患者群體中出現(xiàn)他莫昔芬耐藥的關(guān)鍵分子和信號通路，從而深入了解乳腺癌他莫昔芬耐藥的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 從NCBI的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus，GEO）下載獲取乳腺癌他莫昔芬敏感和耐藥細(xì)胞系的mRNA表達(dá)譜芯片，芯片號GSE26459，提交者為Gonzalez-Malerva L等。mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)來源于AffymetrixHuman Genome U133 Plus2.0Array實(shí)驗(yàn)平臺，平臺號GPL570，包含和24個(gè)樣本（12個(gè)MCF7vs12個(gè)MCF7TAM），樣本號為GSM649484～GSM649507，樣本分 4 組處理：（1）去雌激素血清（對照組）；（2）雌激素（9～10 mol/L）；（3）他莫昔芬（1 μmol/L）；（4）雌激素+他莫昔芬同時(shí)處理。

1.2 生物信息學(xué)分析

1.2.1 數(shù)據(jù)處理與差異表達(dá)基因分析 從GEO數(shù)據(jù)庫中選擇生物芯片GSE26459下載的mRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集導(dǎo)入到R 3.4.3軟件（https://cran.rproject.org/），其中bioconductor具有強(qiáng)大的生物信息分析處理功能。基于clusterProfiler中的raw實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，利用limma篩選出兩組差異表達(dá)基因。選擇他莫昔芬耐藥細(xì)胞系MCF7TAM與他莫昔芬敏感細(xì)胞系MCF7兩組進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P-value＜0.05并且FDR＜0.1并且Fold Change＞2為標(biāo)準(zhǔn)，篩選他莫昔芬耐藥細(xì)胞系MCF7TAM與他莫昔芬敏感細(xì)胞系MCF7的mRNA差異表達(dá)，利用R軟件中的ggplot2繪制熱圖。

1.2.2 差異基因的Gene Ontology（GO）富集和KEGG通路富集分析 利用基因功能注釋分析工具DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）版本6.8對差異基因中顯著上調(diào)和下調(diào)的基因進(jìn)行Gene Ontology富集分析和KEGG通路富集分析(篩選標(biāo)準(zhǔn):P＜0.01)，發(fā)現(xiàn)與ER陽性乳腺癌細(xì)胞系中他莫昔芬耐藥潛在的顯著相關(guān)生物學(xué)過程。

1.2.3 差異基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 利用STRING（http://string-db.org/）版本 10.5，將獲得的差異基因進(jìn)行蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。獲得中心節(jié)點(diǎn)蛋白，及其與其他蛋白的相互作用關(guān)系。

1.2.4 GSEA富集分析 利用GSEA軟件（Gene set enrichment analysis，網(wǎng)址 http://gsea.org/）版本 3.0，利用已篩選出的差異基因集，將差異基因按照在兩類樣本（他莫昔芬耐藥細(xì)胞系和他莫昔芬敏感細(xì)胞系）中的差異表達(dá)程度排序，然后檢驗(yàn)預(yù)先設(shè)定的基因集合是否在這個(gè)排序表的頂端或者底端富集，number of permutations=1 000。

1.2.5 驗(yàn)證候選目標(biāo)分子-ACSL1 結(jié)合乳腺癌內(nèi)分泌耐藥中關(guān)鍵機(jī)制及相關(guān)分子篩選出候選目標(biāo)分子-ACSL1。Western-blotting驗(yàn)證ER陽性乳腺癌他莫昔芬耐藥細(xì)胞中ACSL1的表達(dá)變化情況。同時(shí)結(jié)合CCLE數(shù)據(jù)庫（https://portals.broadinstitute.org/ccle）在RNA-seq芯片中驗(yàn)證ACSL1的組織表達(dá)情況，在 GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/）驗(yàn)證ACSL1組織表達(dá)情況，同時(shí)分析乳腺癌患者中ACSL1高表達(dá)組和低表達(dá)組的生存差異。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)處理與差異表達(dá)基因 分析數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，對篩選出來的差異基因進(jìn)行聚類分析繪制熱圖，見圖1。

圖1 他莫昔芬耐藥細(xì)胞系MCF7TAM與敏感細(xì)胞系MCF7對照共差異基因熱圖Fig 1 Heat map of DEGs expression in tamoxifen-resistance group and tamoxifen-sensitive group

2.2 Gene Ontology富集分析結(jié)果和KEGG通路富集結(jié)果 GO富集分析結(jié)果顯示分子功能富集到輔酶A連接酶的活性、細(xì)胞骨架蛋白連接、蛋白酶連接等功能結(jié)構(gòu)域（表1）。KEGG通路富集到PPAR信號通路、細(xì)胞粘附因子、脂肪酸代謝信號通路、胰島素抵抗通路、AMPK信號通路、FoxO信號通路等信號通路（表 2）。

表1 Gene Ontology富集分析結(jié)果（分子功能）Tab 1 GO categories of DEGs（Molecular Function）

2.3 差異基因的蛋白-蛋白作用網(wǎng)絡(luò) 蛋白-蛋白作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)果分析顯示，整個(gè)網(wǎng)絡(luò)以ACSL1、ACACB、IRS1、TGFB1、COLOA1、CD36、EDN1、TIMP1、TIMP3、LGALS3BP、HIST1H4J、HIST1H2BK、HIST1H2AE、HIST1H2BH、DNAJC12、SLC30A4等蛋白在蛋白作用網(wǎng)絡(luò)中心位置，是蛋白作用網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)（圖2）。

表2 KEGG通路富集結(jié)果（前12條）Tab 2Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway enrichment analysis

圖2 差異基因?qū)?yīng)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析Fig 2 Protein-protein interaction network

2.4 GSEA富集結(jié)果 GSEA富集分析得到了差異基因富集的通路，其中以脂肪酸代謝通路為代表，ES值為正數(shù)，提示基因富集在他莫昔芬耐藥組。在脂肪酸代謝通路中富集的差異基因，其中ACSL1基因在他莫昔芬耐藥組比在敏感組中顯著高表達(dá)且差異最顯著（圖3）。

圖3 GSEA富集分析部分結(jié)果-脂肪酸代謝通路Fig 3 Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)report-Fatty acid metabolism

GSM649484～GSM649495為他莫昔芬敏感細(xì)胞系MCF7，GSM649496～GSM649507為他莫昔芬耐藥細(xì)胞系MCF7TAM，通路富集結(jié)果為耐藥組vs敏感組

2.5 驗(yàn)證候選目標(biāo)分子-ACSL1

2.5.1 western-blotting實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ACSL1表達(dá) WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ACSL1在通過MCF7誘導(dǎo)的他莫昔芬耐藥細(xì)胞系（MCF7TAM）中ACSL1蛋白表達(dá)顯著高于他莫昔芬敏感的（MCF7）細(xì)胞系（圖4）。

2.5.2 數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證ACSL1組織表達(dá)差異和生存差異 在CCLE數(shù)據(jù)庫和GEPIA數(shù)據(jù)庫中查找ACSL1在不同組織中表達(dá)情況得到了相似的結(jié)果，ACSL1在脂肪組織和乳腺組織中均有較高表達(dá)。

圖4 WB驗(yàn)證耐藥細(xì)胞系中ACSL1表達(dá)變化Fig 4 Western-blotting shows the differences of ACSL1 expression

GEPIA數(shù)據(jù)庫分析乳腺癌患者中ACSL1高表達(dá)組和低表達(dá)組的生存曲線（圖5）。發(fā)現(xiàn)高表達(dá)ACSL1的患者總生存時(shí)間有低于ACSL1低表達(dá)組的趨勢。ACSL1在他莫昔芬耐藥中表達(dá)量顯著變化，提示其可能是他莫昔芬耐藥過程中的重要分子。

圖5 GEPIA數(shù)據(jù)庫中ACSL1不同表達(dá)量情況下的總生存差異Fig 5 Over survival with different expression quantities of ACSL1 in GEPIA database

3 討論

本研究經(jīng)過乳腺癌他莫昔芬耐藥相關(guān)基因及通路的篩選分析發(fā)現(xiàn)，差異基因中在脂肪酸代謝相關(guān)的生物學(xué)過程中顯著富集。這提示耐藥機(jī)制中與脂肪酸代謝相關(guān)的分子信號通路和生物學(xué)過程發(fā)生了改變，從而引起耐藥的發(fā)生和ER陽性乳腺癌的進(jìn)展。近年來研究發(fā)現(xiàn)肥胖與乳腺癌發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移有很高的相關(guān)性[6]，而這一通路中涉及胰島素抵抗、脂肪酸代謝、糖異生等代謝相關(guān)的生物學(xué)改變[7]，本研究的分析結(jié)果高度提示這些信號通路在他莫昔芬耐藥的過程中也扮演了重要的角色。

本研究篩選出他莫昔芬耐藥乳腺癌中的候選關(guān)鍵基因，也是脂肪酸代謝信號通路中的關(guān)鍵分子ACSL1。ACSL1屬于長鏈脂肪酸連接酶A家族的同工酶，這個(gè)家族的所有同功酶促進(jìn)游離長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)化為脂肪酰酯，從而在脂質(zhì)合成和脂肪酸降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用。ACSL有4種類型，包括ACSL1、ACSL2、ACSL3、ACSL4，其中在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中ACSL1表達(dá)情況ER陽性型顯著低于其他類型[8]，但是在耐藥細(xì)胞系中ACSL1卻明顯異常高表達(dá)，提示ACSL1與他莫昔芬耐藥相關(guān)。本研究進(jìn)一步對ACSL1進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)庫的雙重驗(yàn)證，顯示ACSL1在ER陽性乳腺癌內(nèi)分泌治療耐藥過程中是候選關(guān)鍵基因，ACSL1表達(dá)上調(diào)參與誘導(dǎo)內(nèi)分泌耐藥發(fā)生，降低患者生存率和生存時(shí)間。

本研究富集到了脂肪酸代謝、細(xì)胞粘附因子、胰島素抵抗等他莫昔芬耐藥相關(guān)分子信號通路。（1）脂肪酸代謝通路可能在他莫昔芬耐藥機(jī)制中起了關(guān)鍵作用。脂肪酸代謝是細(xì)胞生命活動(dòng)中的重要一環(huán)，對于癌細(xì)胞生存來說尤為重要，不停生長的癌細(xì)胞需要大量脂肪酸來組成它的磷脂膜以及提供能量。脂肪代謝參與腫瘤調(diào)控，可能的作用機(jī)制最近有新的研究報(bào)道，脂肪細(xì)胞中的P62蛋白失活會抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白，從而促進(jìn)前列腺腫瘤細(xì)胞關(guān)閉脂肪組織耗能過程，使得腫瘤細(xì)胞吸收脂肪酸和其他能量，加快腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[9]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白抑制劑已經(jīng)被應(yīng)用在很多癌癥的治療上[10]，為新的腫瘤治療靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。脂肪酸代謝途徑中關(guān)鍵酶-脂肪酸合成酶（Fatty AcidSyntheses，F(xiàn)AS）在乳腺癌細(xì)胞比正常乳腺細(xì)胞顯著高表達(dá)，而FAS拮抗劑則可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長，同時(shí)FAS被認(rèn)為是乳腺癌復(fù)發(fā)的可靠預(yù)測指標(biāo)[11-12]。脂肪酸代謝過程受到固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP）調(diào)節(jié)，它在受到生長因子包括胰島素、表皮生長因子等刺激后，激活FAS、ACSL等脂質(zhì)合成的靶基因，促進(jìn)內(nèi)源脂質(zhì)的合成，而內(nèi)源脂質(zhì)是腫瘤細(xì)胞主要脂質(zhì)來源，從而促進(jìn)腫瘤生長[13]，也有學(xué)者提出生長因子通過Akt-SREBP-FAS信號途徑調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[14]。耐藥過程中很可能發(fā)生了脂肪酸代謝通路中關(guān)鍵基因的改變，脂肪酸代謝通路被異常激活，促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞增殖或遷移。但該機(jī)制尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。另一個(gè)可能的機(jī)制是脂肪因子通過激活FoxO信號通路參與內(nèi)分泌耐藥。已有的研究證實(shí)PI3K-AKT-FoxO信號軸是一個(gè)雌激素非依賴性乳腺癌進(jìn)展的關(guān)鍵因素。PI3K-AKT途徑的激活,導(dǎo)致FoxO腫瘤抑制功能下調(diào)，驅(qū)動(dòng)乳腺癌的增殖[15]。（2）胰島素抵抗途徑通過調(diào)控了AMPK信號通路，激活PI3K信號通路，激活c-Jun NH2，從而參與乳腺癌的進(jìn)展[16]。（3）細(xì)胞粘附因子通路與已經(jīng)發(fā)表的實(shí)驗(yàn)結(jié)論相符，實(shí)驗(yàn)證實(shí)在雌激素抵抗的乳腺癌的內(nèi)分泌耐藥機(jī)制中細(xì)胞粘附通路起到重要作用，其中c-src激酶是一個(gè)重要節(jié)點(diǎn)[17]，非雌激素依賴的乳腺癌中細(xì)胞粘附分子如E-鈣粘蛋白表達(dá)下調(diào)，在細(xì)胞間粘附不強(qiáng)的乳腺癌細(xì)胞中，src激酶過度活化可以激活多種信號途徑，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖。

本研究利用生物信息學(xué)有效分析他莫昔芬耐藥乳腺癌的基因芯片數(shù)據(jù)，獲取他莫昔芬耐藥機(jī)制的關(guān)鍵信息，為篩選重要的分子標(biāo)志物提供依據(jù)。