張汝月，李瑞嬌，張引紅，李紅霞，郭興萍*

(1.山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，太原 030001；2. 山西省生殖科學研究所，出生缺陷與細胞再生山西省重點實驗室，太原 030007；3. 山西醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室，太原 030001)

薄型子宮內膜大大影響子宮內膜容受性，導致胚胎著床失敗，或不能維持繼續(xù)妊娠，是生殖醫(yī)學領域中的難題之一[1]，且薄型子宮內膜作為一個重要的易檢測臨床指標，受到了廣大婦科醫(yī)生的關注。臨床一般認為，薄型子宮內膜患者黃體期子宮內膜厚度<7 mm，適宜的子宮內膜厚度(8～14 mm)，會大大增加受精卵著床的可能性[2]。目前，對薄型子宮內膜病因猜測甚多，但臨床尚無明確診斷，也很少能直接獲得可供研究的人體組織標本[3]。因此，建立接近的薄型子宮內膜動物模型并進行相關研究，是科研工作者能想到最為合適的方法。

目前國內外關于子宮損傷的動物模型案例非常多樣化，動物選擇包括牛、豬、獼猴、比格犬、兔、大小鼠等，損傷方法也有機械損傷、電熱損傷、化學試劑損傷以及多種方法聯(lián)合損傷等[4-10]。但目前關于薄型子宮內膜的造模方法僅有一種，即利用高濃度乙醇的脫水及蛋白質變性作用，宮腔注射95%乙醇構建薄型子宮內膜大鼠模型[8-10]，參考該方法及本課題組的初步研究[11]，通過小鼠宮腔內注射95%乙醇建立了薄型子宮內膜小鼠模型，并已通過子宮內膜厚度，HE染色等方面的鑒定證明造模初步成功。但造模成功率較低，且鑒定較為片面，仍需進一步完善。

在前期實驗的基礎上，本實驗對造模方法進行適當?shù)膬?yōu)化，建立薄型子宮內膜小鼠模型，并予以更加全面的結構和功能方面的鑒定，為深入了解薄型子宮內膜的病理特征及尋求有效的治療方法提供理想的動物模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6～8周齡SPF級性成熟且未交配C57BL/6J雌性小鼠78只，體重19～22 g；10周齡SPF級，預實驗已確定有生育能力的C57BL/6J雄性小鼠30只，體重22～25 g。由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供[SCXK(晉)2015-0001]。飼養(yǎng)條件:山西醫(yī)科大學實驗動物中心屏障環(huán)境動物實驗室[SYXK(晉)2015-0001]，每5只一籠，溫度(25±2)℃，濕度(55±2)%，光照明暗時間比為12 h/12 h，自由獲取食物和水。本實驗操作遵循實驗動物倫理學要求(倫理審批號：IACUC2017-004)。

1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉(Ceres Chemical)、無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)、生理鹽水(山東華魯制藥有限公司)、伊紅(Bioswamp)、蘇木素(Bioswamp)、甲醛(國藥集團化學試劑有限公司)、中性樹脂(Bioswamp)、二甲苯(國藥集團化學試劑有限公司)，3% H2O2(國藥集團化學試劑有限公司)、DAB濃縮試劑盒(Bioswamp)、pan-cytpkeratin(H-240):sc-15367(Santa)、ERα(hc-20):sc-543(Santa)、monoclonalanti-vimentin:V-6630 (Sigma)、VEGF antibody(VG-1):ab1316(Abcam)。

研究級正置顯微鏡(Olympus IX51)、組織脫水機(湖北康強醫(yī)療器械有限公司)、石蠟包埋機(湖北泰維科技視野有限公司)、石蠟切片機(徠卡顯微系統(tǒng)有限公司)、攤片烤片機(湖北康強醫(yī)療器械有限公司)、IMS圖像分析系統(tǒng)(武漢華聯(lián)科生物技術有限公司)，恒溫烘箱(上海恒益科學儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

所有實驗動物分為兩組。第一組小鼠30只，隨機分為空白組，對照組和實驗組，每組10只。于第三個動情周期的動情期當日進行造模實驗，造模后的第三個動情期針對角蛋白，波形蛋白，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和雌激素受體α(estrogen receptor α，ERα)進行免疫組化鑒定。第二組48只，隨機分為空白組，對照組，單側損傷組和雙側損傷組，每組12只。造模后第三個動情期進行合籠交配，根據妊娠情況對薄型子宮內膜小鼠模型的生育力進行評估。

1.3.2 薄型子宮內膜小鼠模型的建立

95%乙醇具有迅速使細胞脫水及蛋白質變性的作用，可深入損傷子宮內膜基底層。基于本課題組的初步研究[11]，建立薄型子宮內膜小鼠模型。

本次實驗過程優(yōu)化步驟：(1)整個手術過程以及術后小鼠的蘇醒在動物保溫臺上進行；(2)手術過程選用彎鉤無損傷眼科鑷；(3)于靠近宮頸處插入1 mL注射器，盡量使子宮內膜損傷完全且均勻，并防止注射針穿透子宮導致藥物外漏；(4)宮腔注入95%乙醇時，用無菌紗布保護周圍組織，特別是膀胱及肛門附近區(qū)域。

1.3.3 標本收集

第一組造模后全部存活小鼠進行免疫組化檢測實驗。其中空白組與對照組在造模過程中無小鼠意外死亡，實驗組2只小鼠死亡。于第三個動情期，將造模后所有存活小鼠頸椎脫臼法處死，取出子宮并置于4%多聚甲醛(PFA)中，待下一步研究。

1.3.4 免疫組織化學鑒定

將術后所獲子宮組織垂直包埋，切為大小1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm的標本，切好的組織塊置于10%福爾馬林中固定48 h，隨后依次置于不同濃度的乙醇中逐級脫水，每級2 h。將組織塊進行透明處理、浸蠟后，再進行包埋，切片，最后進行免疫組化染色。

角蛋白、波形蛋白在0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖溶液中進行高壓抗原修復，大火沸騰后中火10 min較為適宜，ERα為中火20 min，VEGF在1 L EDTA抗原修復液中進行修復，同樣為大火沸騰后中火10 min。3% H2O2中濕盒孵育10 min，消除內源性過氧化物酶的活性，并在補充有10%正常山羊血清的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中封閉1 h。然后，將組織切片與針對細胞角蛋白(1∶50)，波形蛋白(1∶200)，VEGF(1∶150)及ERα(1∶100))的一抗一起4℃孵育過夜，添加maxvision二抗，37℃靜置30 min，DAB染色，蘇木精復染，烘干后透明，封片。最后，使用顯微成像系統(tǒng)，每個切片在高倍率(×400)下隨機選取三個區(qū)域以獲得子宮內膜的免疫組織化學切片圖像。通過對細胞角蛋白、波形蛋白、VEGF和ERα的免疫組化檢測來分析子宮內膜細胞的再生情況，采用平均光密度法，平均光密度(AOD mean density)=IOD(integrated optical density)累積光密度/area，并進行組間的分析比較。

1.3.5 生育力評估

第二組造模后全部存活小鼠進行生育力評估實驗。其中空白組與對照組在造模過程中無小鼠意外死亡，實驗組II(單側損傷)1只小鼠死亡，實驗組I(雙側損傷)3只小鼠死亡。所有存活小鼠于第三個動情期的每天下午5：30同時與雄性小鼠以雌雄2∶1的比例進行合籠交配。每天早上08:00觀察陰栓，以確定是否成功交配。

若交配成功，即將雌、雄小鼠分開飼養(yǎng)，并進行標記。若交配不成功，繼續(xù)合籠，但合籠大約一周后，停止合籠。觀察到陰栓約16 d后，將雌性小鼠頸椎脫臼處死以確定懷孕情況。暴露子宮，觀察小鼠子宮妊娠情況，如胚胎數(shù)量、胚胎顏色等，拍照、記錄，并進行組間統(tǒng)計學分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 免疫組織化學鑒定

三個動情周期后，通過免疫組織化學檢測各組子宮內膜細胞角蛋白、波形蛋白、VEGF和ERα的表達。免疫組織化學染色根據待檢測蛋白與其抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑顯色，來確定組織細胞內抗原及其含量，顯色面積與抗原量成正相關。免疫組織化學結果顯示實驗組細胞角蛋白、波形蛋白、VEGF和ERα的平均光密度值(average optical density，AOD)明顯低于空白組和對照組(P< 0.05)，但空白組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)(見圖1～4)。

2.1.1 子宮內膜細胞角蛋白的表達

角蛋白，對維持上皮細胞的形態(tài)完整性有重要作用，主要表達于子宮內膜腺上皮和腔上皮細胞中(見圖1A-C)，細胞角蛋白表達量的高低反映了子宮內膜上皮細胞的生長情況?？瞻捉M與對照組間細胞角蛋白的AOD差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)；然而，與空白組和對照組相比，實驗組的AOD顯著降低(P< 0.01)(見表1)。

2.1.2 子宮內膜細胞波形蛋白的表達

波形蛋白存在于中胚層起源的細胞中，是間質細胞中最主要的中間纖維，主要表達于基質細胞的胞質中(見圖2A-C)，波形蛋白表達量的高低反映了子宮內膜基質細胞的生長情況。免疫組化結果顯示，空白組與對照組間波形蛋白的AOD差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)；然而，與空白組和對照組相比，實驗組的AOD顯著降低(P< 0.01)(見表2)。

2.1.3 子宮內膜VEGF的表達

VEGF是目前已知的促血管生成的重要細胞因子，主要表達于子宮內膜、腺體和血管內皮細胞的細胞質中(見圖3A-C)。 如表3所示，空白組與對照組間VEGF的AOD差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。然而，與空白組和對照組相比，實驗組VEGF顯示出明顯較低的AOD，且差異具有顯著性(P< 0.01)(表3)。

注：A：空白組；B：對照組；C：實驗組。圖1 子宮內膜中細胞角蛋白的表達(×400)Note. A: Blank group; B: Control group; C: Experimental group.Figure 1 Protein expression of cytokeratin in the mouse endometrium. Immunohistochemical staining.

組別Groups空白組(n=10)Blank group對照組(n=10)Control group實驗組(n=8)Experimental group細胞角蛋白Cytokeratin0.071±0.00320.075±0.00200.058±0.0019*#

注：與空白組比較，*P< 0.01；與對照組比較，#P< 0.01。

Note. Compared with the blank group,*P< 0.01. Compared with the control group,#P< 0.01.

注：A：空白組；B：對照組；C：實驗組。圖2 子宮內膜中波形蛋白的表達(×400)Note. A: Blank group; B: Control group; C: Experimental group.Figure 2 Protein expression of vimentin in the mouse endometrium. Immunohistochemical staining.

組別Groups空白組(n=10)Blank group對照組(n=10)Control group實驗組(n=8)Experimental group波形蛋白Vimentin0.049±0.00300.047±0.00160.029±0.0050*#

注：與空白組比較，*P< 0.01；與對照組比較，#P< 0.01。

Note. Compared with the blank group,*P< 0.01. Compared with the control group,#P< 0.01.

注：A：空白組；B：對照組；C：實驗組。圖3 子宮內膜中VEGF的表達(×400)Note. A: Blank group; B: Control group; C: Experimental group.Figure 3 Protein expression of VEGF in the mouse endometrium.Immunohistochemical staining.

組別Groups空白組(n=10)Blank group對照組(n=10)Control group實驗組(n=8)Experimental group血管內皮生長因子VEGF0.051±0.00210.047±0.00200.021±0.0018*#

注：與空白組比較，*P< 0.01；與對照組比較，#P< 0.01。

Note. Compared with the blank group,*P< 0.01. Compared with the control group,#P< 0.01.

2.1.4 子宮內膜ERα的表達

雌激素是調節(jié)子宮內膜生長的主要激素，而雌激素受體是雌激素對子宮內膜發(fā)生作用的橋梁。ERα主要表達于子宮內膜腺上皮和腔上皮細胞的胞核和胞漿中，胞核表達大于胞漿，基質細胞中也有表達(見圖4A-C)。如表4所示，空白組與對照組間ERα的AOD差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。然而，與空白組和對照組相比，實驗組ERα顯示出明顯較低的AOD，且差異具有顯著性(P< 0.01)(表4)。

2.2 生育力評估

生育力是檢驗子宮功能的重要指標，生育力評估實驗也是用于進一步驗證薄型子宮內膜小鼠模型是否建立成功的關鍵方法。

造模過程中，由于實驗操作或化學試劑等影響，空白組和對照組無小鼠意外死亡，實驗組II(單側損傷)一只小鼠意外死亡；而實驗組I(雙側損傷)三只小鼠意外死亡。將造模后所有存活小鼠進行合籠交配用于生育力評估實驗。生育力評估結果顯示，手術損傷側子宮的平均懷孕率明顯低于對側(未損傷側子宮)(P< 0.01)(見表5)。

空白組8只小鼠懷孕，懷孕率為66.7%(與文獻資料接近)[12]，子宮兩側均見胚胎，且胚胎質量良好(見圖5A)；對照組小鼠懷孕情況與空白組相同(見圖5B)；實驗組II有7只小鼠懷孕，懷孕率為63.6%，胚胎位于未損傷一側子宮，且靠近宮頸部位的胚胎較小，發(fā)育不良，考慮可能是由對側子宮注入的95%乙醇的滲入導致。同時，損傷側子宮未見受孕(見圖5C)；實驗組I中僅一只小鼠懷孕，懷孕率為11.1%。子宮體形態(tài)不規(guī)則，粗細不均，子宮顏色發(fā)白或發(fā)黃，且局部有出血點。(見圖5D)。

生育能力評估結果顯示，空白組與對照組比較，小鼠的懷孕率差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。但與其他三組比較，實驗組Ⅰ小鼠的懷孕率顯著降低(P< 0.01)。同時，與空白組和對照組相比，實驗組II整體懷孕率差異具有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)，但損傷側和未損傷側子宮的懷孕率之間存在顯著性差異(P< 0.01)(見表5)。

注：A：空白組；B：對照組；C：實驗組。圖4 子宮內膜中ERα的表達(×400)Note. A: Blank group; B: Control group; C: Experimental group.Figure 4 Protein expression of ERα in the mouse endometrium.Immunohistochemical staining.

組別Groups空白組(n=10)Blank group對照組(n=10)Control group實驗組(n=8)Experimental group雌激素受體αERα0.059±0.00420.063±0.00360.041±0.0043*#

注：與空白組比較，*P< 0.01；與對照組比較，#P< 0.01。

Note. Compared with the blank group,*P< 0.01. Compared with the control group,#P< 0.01.

注：A：空白組，子宮兩側均見胚胎，胚胎質量較好；B：對照組，子宮兩側均見胚胎，胚胎質量良好；C：實驗組II(單側損傷)，胚胎位于未損傷一側子宮，且靠近宮頸部位的胚胎較小，發(fā)育不良， 損傷側子宮未見受孕；D：實驗組I(雙側損傷)，子宮體形態(tài)不規(guī)則，粗細不均，子宮顏色發(fā)白或發(fā)黃，且局部有出血點。圖5 合籠后四組小鼠的懷孕情況Note. A: In the blank group, embryos were present in the bilateral uterus, and the quality of embryos was good. B: In the control group, embryos were present in both sides of the uterus and the embryos were of good quality. C: In experimental group II (unilateral injury), embryos were present in the undamaged side of the uterus, but embryos were smaller and dysplasia occurred near the cervix. No embryos were found in the damaged side of the uterus. D: In the experimental group I (bilateral injury), the uterus was irregular in shape, uneven in thickness, and whitish or yellow in color with some bleeding.Figure 5 Pregnancy in the mice of the four groups after being caged

組別Groups存活小鼠數(shù)量Number of surviving mice懷孕數(shù)量Number of pregnant mice懷孕率(%)Pregnancy rate空白組Blank group12866.7對照組Control group12866.7實驗組II(單側損傷)Experimental group II (unilateral injury)11763.6*#實驗組I(雙側損傷)Experimental group I (bilateral injury)9111.1**##

注：與空白組比較，*P< 0.05,**P< 0.01；與對照組比較，#P< 0.05,##P< 0.01。

Note. Compared with the blank group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the control group#P< 0.05,##P< 0.01.

3 討論

薄型子宮內膜嚴重威脅著育齡女性的生育健康，更是臨床醫(yī)生經常會遇到的棘手難題。Miwa等[13]描述薄型子宮內膜的特點是腺體上皮細胞生長受限、子宮內膜血流阻力高、血管內皮細胞生長因子生成降低，并且血管發(fā)育較差。針對這一難題，臨床上目前尚未建立統(tǒng)一的診治標準。有關薄型子宮內膜治療的方式很多，主要包括補充雌激素、促性腺激素釋放激素激動劑等的內分泌治療[14-15]；服用小劑量阿司匹林、己酮可可堿和維生素E等改善子宮內膜血流灌注的治療[16-18]；以及植入粒細胞-集落刺激因子(G-CSF)[19]和骨髓間充質干細胞(BMSCs)[1]等促進子宮內膜再生的新方法等，但治療效果并不顯著，尤其是個體差異非常明顯[20]。隨著誘導胚胎干細胞、骨髓干細胞、脂肪干細胞等[21-23]相關干細胞技術的不斷成熟，干細胞療法被認為可能是未來最有前景的治療方法之一[24]。因此，建立一個相似度高且穩(wěn)定的實驗動物模型，為下一步的干細胞或者其他的相關治療方案提供基礎，顯得尤為重要。

本課題參考高紅[8]構建薄型子宮內膜大鼠模型所用高濃度乙醇宮腔注射損傷法。無水乙醇具有迅速使細胞脫水及蛋白質變性的作用，可對子宮內膜基底層造成損傷，效果顯著，且注射劑量及注射時間易于控制。本課題組前期研究[11]發(fā)現(xiàn)可能由于小鼠麻醉后新陳代謝較慢，無法維持正常體溫，再加之術前75%乙醇對表皮消毒進一步加速了周邊溫度降低，而手術僅在普通手術板上進行，相關的術中及術后保溫條件較差，小鼠的存活率較低；同時發(fā)現(xiàn)在術后恢復過程中，個別小鼠出現(xiàn)脫肛的現(xiàn)象，考慮可能是無水乙醇殘留外漏所致。因此，本次實驗對前期實驗過程進行了適當優(yōu)化，選擇整個手術過程以及術后小鼠的蘇醒在動物保溫臺上進行，完善了保溫條件；宮腔注入95%乙醇時，用無菌紗布保護周圍組織，特別注意保護小鼠膀胱和肛門附近區(qū)域，并防止注射針穿透子宮導致乙醇外漏以及注射過程中拉直子宮選用彎鉤無損傷眼科鑷，損傷后及時將無水乙醇吸出，酌情增加生理鹽水沖洗次數(shù)等，盡可能避免因乙醇外漏對實驗動物其他組織部位造成損傷。本課題組前期研究[11]已對造模后小鼠子宮從子宮外觀形態(tài)、顏色，組織結構和子宮內膜厚度等方面對薄型子宮內膜小鼠模型進行鑒定，研究發(fā)現(xiàn)，95%乙醇宮腔注射后，小鼠子宮迅速脫水、變白、失去彈性；三個動情周期后，小鼠子宮體形態(tài)不規(guī)則，且局部有出血點，紅白相間[11]。HE染色顯示，與空白組和對照組相比，實驗組子宮內膜層較薄，腺體和血管數(shù)量均減少，血管分布情況改變[11]，這與Asherman綜合征中子宮內膜的變化類似[25]，也符合臨床薄型子宮內膜相關癥狀。

子宮內膜是一種具有高度動態(tài)循環(huán)的組織，可發(fā)生周期性的變化，主要由上皮細胞、基質細胞和血管細胞組成[26]。細胞角蛋白、波形蛋白和VEGF分別表達于上皮細胞、基質細胞和血管細胞，因此，這些指標表達量的高低反映了子宮內膜細胞的生長情況，進而反映子宮內膜再生情況。細胞角蛋白是外胚層細胞的重要蛋白，主要功能是維持上皮組織的完整性和連續(xù)性，且細胞中角蛋白的含量與上皮細胞的增殖分化密切相關。波形蛋白是間質細胞中最主要的中間纖維，與微管、微絲共同形成一個細胞支架網絡來維持間質細胞的完整性。VEGF則是一種重要的血管生成因子，通過增加血管通透性，改變血管內皮細胞中的基因表達譜和促進血管內皮細胞的有絲分裂進而促進新血管形成[27]，為子宮內膜再生提供充分的血流灌注。免疫組化檢測顯示實驗組子宮內膜細胞角蛋白和波形蛋白的表達顯著低于空白組和對照組，并且實驗組中新生毛細血管數(shù)量明顯減少。由此可見，本實驗構建的薄型子宮內膜小鼠模型是成功的。同時，ERα是子宮內ER的主要亞型，在雌激素介導的子宮內膜細胞增殖和生長過程中起主導作用[28]，因此，ERα也是反映子宮內膜細胞生長情況的重要指標之一。本研究發(fā)現(xiàn)，實驗組子宮內膜ERα的表達較空白組和對照組顯著降低。ERα表達的降低也符合薄型子宮內膜的病理特征。

參考相關文獻[29-31]，為了驗證造模是否成功，對模型都做了關于生育力評估的實驗。并且本次建立薄型子宮內膜小鼠模型的最終目的是研究修復薄型子宮內膜的方法及相關機制，因此，生育力評估也是驗證后期修復實驗是否成功的重要環(huán)節(jié)。本次研究中，生育力評估實驗結果顯示，實驗組中損傷側子宮的平均懷孕率與未損傷側子宮的平均懷孕率相比有顯著性差異，進一步表明成功建立了薄型子宮內膜小鼠模型，且發(fā)現(xiàn)在單側損傷實驗組中損傷側子宮并不影響對側子宮的受孕情況，這表明損傷側子宮的生育力下降的確是由宮腔注射95%乙醇導致。

以上研究結果表明，本實驗通過宮腔注射95%乙醇已經成功建立薄型子宮內膜的C57BL/6J小鼠模型，為進一步研究薄型子宮內膜的形成、修復機制以及尋求有效的治療手段提供了理想的動物模型。