張文娟，許璟瑾，姚麗云，李秀敏，潘裕添，薛 鈺,2*

(1.閩南師范大學(xué)福建省菌類活性物質(zhì)工程技術(shù)研究中心， 福建 漳州 363000；2.膜生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100101)

氨基葡萄糖鹽酸鹽(glucosamine hydrochloride，GAH)又名葡糖胺鹽酸鹽，是天然氨基單糖衍生物之一，而氨基葡萄糖是軟骨基質(zhì)中合成蛋白聚糖所必需的重要成分[1-2]。前期的研究結(jié)果表明， GAH對斑馬魚骨骼的發(fā)育及損傷有明顯的促進及修復(fù)作用。

而與GAH有類似結(jié)構(gòu)的糖類及衍生物有很多，如：葡萄糖(glucose，Glu)；葡萄糖的同分異構(gòu)體D-半乳糖(D-Galactose，Gal)；由葡萄糖的同分異構(gòu)體甘露糖加氫而得到的甘露醇(manntiol，Man)；與GAH類似的氨基糖衍生物N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine，NAG)[3-5]。本文以斑馬魚為模型，探索比較GAH及其衍生物對斑馬魚幼魚骨骼損傷修復(fù)及預(yù)防的效果。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

TU品系斑馬魚，由清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院孟安明課題組惠贈。飼養(yǎng)于本課題組的斑馬魚水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，斑馬魚的養(yǎng)殖和繁殖參照標(biāo)準(zhǔn)方法[6-7]。將性成熟(3月齡)的雌雄斑馬魚放入交配缸中，插入隔板；次日清晨撥開擋板待交配產(chǎn)卵，斑馬魚胚胎在受精后30 min內(nèi)收集，洗滌后放入90 mm培養(yǎng)皿，加入Holfreter水(0.05 g/L KCl，0.1 g/L CaCl2，0.025 g/L NaHCO3，3.5 g/L NaCl)培養(yǎng)于28℃恒溫培養(yǎng)箱中，在體式顯微鏡下挑選發(fā)育正常胚胎，用于試驗。動物實驗遵循3R原則。

1.2 實驗藥物及儀器

本研究所用GAH藥物是從雙孢蘑菇中提取所得，與傳統(tǒng)從蝦蟹殼來源相比，避免了過敏、嘔吐等不良反應(yīng)，擴大了適用人群。葡萄糖和甘露醇(AMRESCO)；D-半乳糖溶液(國藥集團)；N-乙酰葡萄糖溶液(上海源聚生物科技有限公司)；阿侖膦酸鈉片(默沙東制藥)；枸櫞酸鐵銨(Sigma，F(xiàn)5879-100G)。

AUY320日本島津電子分析天平(上海儀田精密儀器有限公司)；PYX-280-A生化培養(yǎng)箱(科力儀器有限公司)；ZD-9550轉(zhuǎn)移搖床(海門其林貝爾)；MS-H-S磁力攪拌器(武漢華科達實驗設(shè)備有限公司)；Nikon SMZ18體式熒光顯微鏡(日本)。

1.3 實驗方法

1.3.1 胚胎的藥物處理

以6孔板為實驗容器，每孔50枚胚胎，根據(jù)前期的實驗條件及已有的研究報道[8]，選用0.1%(1 mg/mL)的工作濃度，將斑馬魚受精后0.75 h的胚胎分別暴露在葡萄糖溶液(Glu)、甘露醇溶液(Man)、D-半乳糖溶液(Gal)、N-乙酰葡萄糖胺溶液(NAG)和GAH溶液中，以未加藥組即Holfreter水培養(yǎng)為對照，每個處理組至少50枚胚胎，每12 h更換一次溶液，同時設(shè)置3個平行樣。觀察斑馬魚胚胎發(fā)育到36 h的生長狀況及死亡情況。

1.3.2 阿爾新藍和茜素紅染色

阿爾新藍染色是一種能夠特異性地染色軟骨細(xì)胞胞外基質(zhì)的染料，發(fā)育生物學(xué)研究中一般使用該染色方法檢測胚胎骨骼的形成和軟骨的發(fā)育情況[9-10]。茜素紅能與骨骼中鈣離子以螯合方式形成復(fù)合物，可識別骨的鈣鹽成分，與骨中的鈣結(jié)節(jié)產(chǎn)生顯色反應(yīng)，因此可用來檢測魚的骨形態(tài)和骨密度[11]。阿爾新藍和茜素紅染色方法參照文獻[12]。染色完成后，觀察斑馬魚骨骼的修復(fù)狀況，并拍照記錄。

1.3.3 不同藥物對斑馬魚骨質(zhì)疏松癥的修復(fù)作用分組

收集48 hpf(hours post-fertilization)的斑馬魚幼魚，分為對照組(WT，正常的養(yǎng)魚水培養(yǎng)至第10天)；FAC組(500 μg/mLFAC培養(yǎng)至第10天)；Man組(FAC培養(yǎng)4 d，再換成0.1%甘露醇溶液培養(yǎng)4 d)；Glu組(FAC培養(yǎng)4 d，再換成0.1%葡萄糖溶液培養(yǎng)4 d)；NAG組(FAC培養(yǎng)4 d，再換成0.1% N-乙酰葡萄糖胺溶液培養(yǎng)4 d)，Gal組(FAC培養(yǎng)4 d，再換成0.1%半乳糖溶液培養(yǎng)4 d)；GAH組(FAC培養(yǎng)4 d，再換成0.1% GAH培養(yǎng)4 d)，共7組。對培養(yǎng)10 d的7組幼魚進行阿爾新藍染色和茜素紅染色。

1.3.4 GAH和阿倫膦酸鈉對骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防作用分組

收集24 hpf的斑馬魚胚胎，分成 4組，分別為對照組(CTR)：正常的養(yǎng)魚水培養(yǎng)至第10天；CTR+FAC組：先用H2O培養(yǎng)5 d，再用500 μg/mLFAC培養(yǎng)4 d；AL+FAC組：先用0.1%AL培養(yǎng)5 d，之后用FAC培養(yǎng)4 d；GAH+FAC組：先用0.1% GAH培養(yǎng)5 d，再換成FAC培養(yǎng)4 d。對培養(yǎng)10 d的4組進行茜素紅染色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 相同濃度下不同藥物對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

與對照組相比，半乳糖與N-乙酰葡萄糖胺溶液的斑馬魚胚胎死亡率最高，且發(fā)育有明顯的延緩；葡萄糖與甘露醇對斑馬魚胚胎的影響較小，與對照組的死亡率基本相同，發(fā)育速度正常；GAH的死亡率為22%，發(fā)育正常且一致?？傮w分析對斑馬魚胚胎發(fā)育影響的大小依次為葡萄糖<甘露醇

圖1 相同濃度的不同樣品對斑馬魚胚胎死亡率的影響(n≥50)Figure 1 Embryo mortality rate at the same concentration of various agents

2.2 不同藥物對斑馬魚骨質(zhì)疏松癥的修復(fù)作用

2.2.1 對軟骨損傷的修復(fù)比較

通過阿爾新藍染色檢測不同處理組的軟骨發(fā)育狀況，與FAC組相比，Man組和Glu組染色基本一致，其骨骼染色沒有變化；Gal組和NAG組，在副蝶骨、角舌骨、腭方骨及角鰓骨等部位的染色與Glu組和Man組相比加深，且Gal組比NAG組的染色更深；而GAH組的整個頭部骨骼染色明顯加深，與對照組較為接近。(圖2a～g)

統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，Glu組、Man組、NAG組的染色面積與FAC組相比差異無顯著性(P> 0.05); Gal組的染色面積顯著性增加(P< 0.01); GAH組的染色面積極顯著增加(P< 0.001)，表明GAH對斑馬魚軟骨的損傷修復(fù)效果最好。(圖2 h)

注：(ch)角舌骨；(ps)副蝶骨；(mk)麥柯耳軟骨；(hm)舌骨下頜弓；(pq)腭方骨；(cbr1-5)角鰓骨；(op)孔蓋；(nc)脊索；(ot)耳石。與FAC組比較，**P< 0.01，***P < 0.001。圖2 不同糖類對FAC誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松模型斑馬魚軟骨的修復(fù)作用(Bar=100 μm)Note. ch: Ceratohyal; ps: Parasphenoid; mk: Meckel’s cartilage; hm: Hyomandibula; pq: Palatoquadrate; cbr1-5: Ceratobranchia; op: Operculum. nc: Notochord. ot: Otolith.Compared with the FAC group，**P< 0.01 and ***P < 0.001.Figure 2 Effect of various agents on the cartilage developmental defects induced by FAC

2.2.2 對硬骨損傷的修復(fù)比較

通過茜素紅染色觀察骨密度及骨形態(tài)，結(jié)果表明：與FAC組相比，Man組和Glu組的基本一致，染色都在其頭部的脊索和匙骨稍有加深；Gal組與NAG組的副蝶骨、角舌骨、麥柯耳軟骨及匙骨等部位的顏色比Glu組和Man組深；而GAH組的恢復(fù)效果最為顯著，整個頭部的骨骼染色與對照組接近，并且明顯能看到兩節(jié)脊椎。(圖3 a～g，)

統(tǒng)計結(jié)果顯示，與FAC組相比，Glu組、Man組、NAG組的染色面積無顯著性差異(P> 0.05); Gal組的染色面積顯著性增加(P< 0.01); GAH組的染色面積極顯著增加(P< 0.001)。

骨密度的變化趨勢與染色面積的變化趨勢一致。由此說明，GAH對斑馬魚的骨骼損傷修復(fù)效果最好，同時，在后期藥物修復(fù)的過程中，GAH組死亡率為零，而Gal組與NAG組陸續(xù)出現(xiàn)死亡，側(cè)面反映了GAH的藥效溫和。(圖3 h～i)

2.3 不同藥物對骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防作用

與CTR組相比，其它三組的染色深度有不同程度的減弱。CTR+FAC組中的副蝶骨和脊索的染色信號顯著減弱；匙骨、孔蓋和鰓條骨等部位的染色區(qū)域也明顯減小。AL+FAC組的斑馬魚頭部染色整體變淺，染色面積也顯著減少，且有明顯的殘留藥物(FAC)，只有匙骨、脊索和孔蓋可見染色信號。而在GAH+FAC組中的麥柯耳軟骨、軟骨內(nèi)成骨、孔蓋、鰓條骨、舌骨下頜弓和脊椎骨都清晰可見，尤其是匙骨和脊索的染色強度與對照組非常接近，說明經(jīng)GAH處理后，可明顯減緩FAC引發(fā)的骨損傷。(圖4)

3 討論

斑馬魚是一種優(yōu)良的骨骼研究動物模型，它與人類在骨骼發(fā)育過程中的基因、信號通路有高度同源性，與其他的動物模型相比，具有個體小適合高通量化學(xué)篩選、幼魚身體透明易于觀察骨骼發(fā)育的特點，所以近年來以斑馬魚為模型的骨骼研究逐漸成為這一領(lǐng)域的熱點[16-17]。斑馬魚的骨骼發(fā)育是一個從頭到尾的進程，其整個脊椎發(fā)育完成需要23 d左右。本研究對發(fā)育至第10天的斑馬魚幼魚進行骨骼染色，此時其顱骨已基本形成，脊椎應(yīng)發(fā)育至第9脊椎，當(dāng)用藥物(FAC)處理后，本該在此時期形成的骨骼出現(xiàn)缺失，導(dǎo)致一系列檢測指標(biāo)下調(diào)，與Zhang等[18]報道的骨質(zhì)疏松癥表型一致。

實驗結(jié)果表明，對斑馬魚胚胎發(fā)育影響的大小依次為：葡萄糖<甘露醇

GAH對FAC引起的損傷有一定的預(yù)防作用，優(yōu)于阿侖膦酸鈉片。同時，在AL+FAC組處理過程中出現(xiàn)了較高的死亡率，且后期染色有明顯殘留物，說明在正常狀態(tài)下服用阿侖膦酸鈉，不僅不能起到預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用，反而對正常的機體有損害，此結(jié)果為未來GAH作為保健品開發(fā)，用于骨質(zhì)疏松預(yù)防提供了初步的實驗支撐。

注：(a～g)斑馬魚頭骨染色的腹面觀；(a’～g’)斑馬魚頭骨染色的側(cè)面觀；(mk)麥柯耳軟骨；(hm)舌骨下頜弓；(op)孔蓋；(cl)匙骨；(ps)副蝶骨；(oc)枕骨;(ch)角舌骨；(bs)鰓條骨；(ot)耳石；(nc)脊索；(spine)脊椎骨。與FAC組比較，**P< 0.01，***P < 0.001。圖3 不同糖類對FAC誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松模型斑馬魚骨骼修復(fù)作用的比較(Bar=100 μm)Note. (a-g) Ventral view of alizarin red stained 10 dpf zebrafish larvae (left column). (a′-g′) Lateral view of alizarin red stained 10 dpf zebrafish larvae (right column). Note. mk: Meckel’s cartilage; hm: Hyomandibula. op: operculum; cl: Cleithrum; ps: Parasphenoid. oc: Occipital; ch: Ceratohyal; bs: Branchiostegal; ot: Otolith; nc: Notochord. Compared with the FAC group， **P< 0.01 and ***P < 0.001.Figure 3 Effect of the various agents on bone developmental defects induced by FAC in larvae

注：(mk)麥柯耳軟骨；(en)軟骨內(nèi)成骨；(ps)副蝶骨；(nc)脊索；(cl)匙骨；(op)孔蓋；(spine)脊椎骨；(bs)鰓條骨；(hm)舌骨下頜弓。圖4 GAH對骨質(zhì)疏松的預(yù)防作用(Bar=100 μm)Note. Note. mk: Meckel’s cartilage; en: Entochondrostosis; ps: Parasphenoid; nc: Notochord; cl: Cleithrum; op: Operculum; bs: Branchiostegal; hm: Hyomandibula.Figure 4 Preventive effect of GAH on osteoporosis