李雪 ，郭立平 ，劉華林 ，戚廷香 ，王海林 ，唐會(huì)妮 ，張學(xué)賢 ，喬秀芹 ，吳建勇 *，邢朝柱 *

（1.棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部棉花生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，河南安陽(yáng)455000；2.安徽天長(zhǎng)市農(nóng)業(yè)委員會(huì)，安徽天長(zhǎng)239300）

棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，與人民生活息息相關(guān)，棉花產(chǎn)量雜種優(yōu)勢(shì)可達(dá)到10%以上[1-3]。棉花雜種優(yōu)勢(shì)利用對(duì)于提高棉花產(chǎn)量、增加農(nóng)民收入、提高棉花產(chǎn)業(yè)和國(guó)民經(jīng)濟(jì)效益具有十分重要的作用[3-4]。棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育“三系”（不育系、保持系和恢復(fù)系）制種因其能夠簡(jiǎn)化制種，節(jié)約勞動(dòng)力成本而備受歡迎，然而棉花恢復(fù)系來(lái)源狹窄，恢復(fù)力較弱等問(wèn)題使其育種周期較長(zhǎng)，缺少能夠在早期預(yù)測(cè)雜種表現(xiàn)的方法。研究表明，與恢復(fù)系及正常雜交種相比，棉花不育系與恢復(fù)系雜交所得F1的花粉育性有下降的趨勢(shì)，最終可能會(huì)影響到棉花的產(chǎn)量[3，5-7]。研究結(jié)果表明水稻、小麥的花粉育性與結(jié)實(shí)率有一定的相關(guān)性[8-12]，而棉花中較少有報(bào)道?？捎ǚ勐适腔ǚ塾缘囊粋€(gè)重要指標(biāo)。本研究利用聯(lián)苯胺-甲萘酚法測(cè)定花粉育性，計(jì)算棉花可育花粉率，明確“三系”制種的F1花粉育性及其與產(chǎn)量、品質(zhì)性狀之間的相關(guān)性，以期為高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)“三系”品種篩選提供依據(jù)，探索在早期預(yù)測(cè)三系雜交棉產(chǎn)量品質(zhì)，提高育種效率的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究所用的12個(gè)哈克尼西棉細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及4個(gè)恢復(fù)系及對(duì)照材料中棉所97見(jiàn)表1。2015年利用不完全雙列雜交設(shè)計(jì) （North Carolina Mating Design Ⅱ design，NCⅡ）產(chǎn)生 48 個(gè) F1，2016年4月下旬將F1及其親本材料植于河南省安陽(yáng)縣中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所東場(chǎng)試驗(yàn)地，田間管理同普通大田管理。

1.2 試驗(yàn)方法

8月5日上午9:00―10:00，隨機(jī)取中棉所97當(dāng)日即將開(kāi)放的花5朵，保存于－20℃冰箱，分別于取花后 4 h，8 h，14 h，25 h，37 h 和 51 h 用聯(lián)苯胺-甲萘酚法[13-17]測(cè)定花粉育性，研究其可育花粉率隨時(shí)間變化的情況。測(cè)定方法:用鑷子隨機(jī)取每朵花中部花藥5粒放載玻片上，用聯(lián)苯胺-甲萘酚試劑染色后在顯微鏡下觀察，生活力強(qiáng)的花粉染成深紅色，生活力弱的染成淺紅色，無(wú)生活力的則不著色。隨機(jī)取3個(gè)視野（觀察總花粉數(shù)約200個(gè)）進(jìn)行拍照記錄，計(jì)算每朵花的可育花粉率（可育花粉率＝深色和淺色花粉個(gè)數(shù)/總觀察個(gè)數(shù)×100%），測(cè)定后繼續(xù)在－20℃冰箱保存。

表1 試驗(yàn)材料

8月8日，9日上午9:00―10:00隨機(jī)取F1，恢復(fù)系及中棉所97當(dāng)日即將開(kāi)放的花5朵，保存于－20℃冰箱待測(cè)，當(dāng)天用聯(lián)苯胺-甲萘酚法測(cè)定花粉育性，測(cè)定時(shí)用鑷子隨機(jī)取每朵花中部花藥5粒放載玻片上，用聯(lián)苯胺-甲萘酚試劑染色后顯微鏡下觀察，隨機(jī)取5個(gè)視野（觀察總花粉數(shù)500個(gè)左右），拍照記錄后計(jì)算每朵花的可育花粉率。

1.3 田間數(shù)據(jù)收集

9月中旬吐絮期前調(diào)查小區(qū)內(nèi)株數(shù)、鈴數(shù)，以是否出苞葉為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)，單株鈴數(shù)＝鈴數(shù)/株數(shù)。10～11月收50鈴，考種計(jì)算棉花衣分，根據(jù)衣分和小區(qū)籽棉產(chǎn)量計(jì)算小區(qū)皮棉產(chǎn)量:皮棉產(chǎn)量＝小區(qū)籽棉產(chǎn)量×衣分，纖維品質(zhì)由（原）農(nóng)業(yè)部棉花品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心檢測(cè)，用HVI900B纖維檢測(cè)儀檢測(cè)纖維品質(zhì)5項(xiàng)指標(biāo):纖維上半部平均長(zhǎng)度、整齊度指數(shù)、馬克隆值、伸長(zhǎng)率和斷裂比強(qiáng)度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用MSExcel整理、制表和繪圖，并進(jìn)行方差分析 （百分比數(shù)據(jù)已反正弦轉(zhuǎn)換），IBM SPSSstatistics 19.0進(jìn)行簡(jiǎn)單相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 －20℃貯藏溫度下花粉活力隨時(shí)間變化分析

為確定冰上取樣、－20℃保存對(duì)花粉育性是否有顯著影響，本研究測(cè)定了取樣后51 h內(nèi)花粉育性（圖1）。由圖1可以看出－20℃貯藏花粉，花粉育性隨著貯藏時(shí)間的增加而減弱，在取樣后8 h內(nèi)花粉育性下降較快，8～25 h花粉育性變化趨于平緩，25～37 h下降速度加快，取樣后51 h花粉育性依然保持在88%以上。方差分析結(jié)果表明:隨機(jī)取得的5朵花的花粉育性無(wú)顯著性差異，且－20℃保存51 h內(nèi)花粉育性無(wú)顯著差異。所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)樣品在當(dāng)天測(cè)定花粉育性。

圖1 －20℃保存條件下可育花粉率隨時(shí)間變化

2.2 “三系”雜交F1可育花粉率分析

2.2.1恢復(fù)系恢復(fù)力分析。表2所示為“三系”雜交組合F1的可育花粉率，及與恢復(fù)系和中棉所97的比較。結(jié)果表明:48個(gè)F1的可育花粉率為42.9%～92.37%，大部分為75%～90%，本研究中一半以上組合的可育花粉率達(dá)80%，說(shuō)明4個(gè)恢復(fù)系可恢復(fù)大部分不育系的育性。與恢復(fù)系相比，F(xiàn)1的可育花粉率低－0.02～48.22百分點(diǎn)；與中棉所97相比，F(xiàn)1的可育花粉率低1.9～51.37百分點(diǎn)；除A12×R4外，其他組合F1的可育花粉率均低于其恢復(fù)系及中棉所97，大部分在20百分點(diǎn)以內(nèi)，極個(gè)別達(dá)到40百分點(diǎn)以上，說(shuō)明“三系”雜交F1可育花粉率降低且普遍低于恢復(fù)系與普通雜交種。4個(gè)恢復(fù)系與不育系雜交的F1可育花粉率平均值R4＞R3＞R1＞R2，說(shuō)明不同恢復(fù)系對(duì)不育系的恢復(fù)力有明顯的差異。除 R4×A6，R4×A10外，R4所配組合可育花粉率均較高，說(shuō)明其恢復(fù)力較強(qiáng)，育種中可多選用R4進(jìn)行配組。

表2 “三系”雜交F1可育花粉率及與恢復(fù)系與對(duì)照中棉所97的比較

2.2.2不育系花粉被恢復(fù)系恢復(fù)潛力分析。表3所示，不同不育系組配的的F1平均可育花粉率A8＞A2＞A3＞A12＞A7＞A5＞A4＞A1＞A6＞A9＞A10＞A11；除 A6、A9、A10、A11外，其它不育系組配的 F1的平均可育花粉率均達(dá)到80%以上，說(shuō)明不同不育系被恢復(fù)的潛力表現(xiàn)不同。不育系A(chǔ)2、A8配組的F1可育花粉率達(dá)到85%以上，說(shuō)明這2個(gè)不育系容易被本研究中的恢復(fù)系恢復(fù)，在配組中表現(xiàn)優(yōu)秀，可多選用其配組。

2.3 “三系”雜交F1可育花粉率與產(chǎn)量性狀相關(guān)分析

表4所示為F1可育花粉率與產(chǎn)量性狀的Pearson相關(guān)系數(shù)表，結(jié)果表明“三系”雜交F1可育花粉率與單株鈴數(shù)呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明可育花粉率對(duì)棉花成鈴數(shù)具有顯著影響。另外，籽棉產(chǎn)量、皮棉產(chǎn)量與鈴重、單株鈴數(shù)呈極顯著正相關(guān)，說(shuō)明鈴重和單株鈴數(shù)極顯著地影響棉花產(chǎn)量。

表3 各不育系配制的雜交組合的平均可育花粉率及比較

表4 “三系”雜交棉F1組合可育花粉率與產(chǎn)量性狀相關(guān)性

2.4 “三系”雜交F1可育花粉率與品質(zhì)性狀的相關(guān)分析

“三系”雜交F1可育花粉率與品質(zhì)性狀的相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表5。結(jié)果表明:可育花粉率與纖維品質(zhì)主要指標(biāo)的相關(guān)性均不顯著，說(shuō)明可育花粉率對(duì)纖維品質(zhì)的影響不大。另外，纖維上半部平均長(zhǎng)度與斷裂比強(qiáng)度和伸長(zhǎng)率極顯著正相關(guān)，斷裂比強(qiáng)度與馬克隆值呈極顯著負(fù)相關(guān)而與伸長(zhǎng)率呈極顯著正相關(guān)。

表5 “三系”雜交棉F1組合可育花粉率與品質(zhì)性狀相關(guān)系數(shù)表

3 討論

3.1 貯藏時(shí)間及測(cè)定方法對(duì)花粉育性的影響

離體花粉在一定的溫度下隨時(shí)間的加長(zhǎng)花粉育性有下降的趨勢(shì)，對(duì)其保存時(shí)間，不同研究者有不同的看法。胡磊等[15]認(rèn)為離體花粉在4℃和－20℃下保存1～3 d花粉育性沒(méi)有顯著性差異；王剛等的[17]研究結(jié)果認(rèn)為花粉貯藏溫度以5℃最佳，1～3 d內(nèi)花粉育性都在90%以上；而景憶蓮等[18]的研究結(jié)果表明自然花粉育性可維持1 d，以9:30―10:30的育性較強(qiáng)，隨后隨時(shí)間推后大幅度衰減，低溫保存可維持其花粉活性。本研究中花粉在－20℃保存51 h的花粉育性無(wú)顯著差異，與胡磊等[15]的研究結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)在當(dāng)天測(cè)完所有F1的花粉育性盡可能地減小了實(shí)驗(yàn)誤差。本研究中可育花粉率隨時(shí)間變化的趨勢(shì)可為制種過(guò)程中人工授粉提供參考，解決花期不遇、異時(shí)異地授粉的問(wèn)題，提高授粉效率。已知的花粉育性測(cè)量方法很多[19]，聯(lián)苯胺-甲萘酚法在棉花花粉育性測(cè)定方法中高效且常用，但其染色界限不夠明確，會(huì)有一定的實(shí)驗(yàn)誤差[14-15，17，19，25]。本實(shí)驗(yàn)是對(duì)花粉育性與產(chǎn)量品質(zhì)關(guān)系的初步探索，仍需采用更精確的方法進(jìn)一步研究。

3.2 “三系”雜交組合花粉育性表現(xiàn)

王學(xué)德等[20]的研究結(jié)果表明當(dāng)含有育性增強(qiáng)基因時(shí)，F(xiàn)1的花粉育性平均值與恢復(fù)系僅相差3.19百分點(diǎn)，差別不大；無(wú)育性增強(qiáng)基因時(shí)其育性低于恢復(fù)系，相差12.24百分點(diǎn)。韋貞國(guó)等[21]的研究表明不育系與恢復(fù)系雜交所得F1的育性存在差別，且育性較恢復(fù)系低，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人的研究結(jié)果基本一致。本實(shí)驗(yàn)中F1的可育花粉率為42.9%～92.37%，除1個(gè)組合外均低于恢復(fù)系的育性水平，與恢復(fù)系可育花粉率相差－0.02～48.22百分點(diǎn)。這可能是同一恢復(fù)基因在不同不育系的遺傳背景下表達(dá)強(qiáng)弱不同從而導(dǎo)致恢復(fù)力不同，也可能與育性增強(qiáng)基因的表達(dá)有關(guān)。H46（R4）組配的大部分F1可育花粉率高于85%，表明該恢復(fù)系較其他三個(gè)恢復(fù)系的恢復(fù)力強(qiáng)。同一恢復(fù)系在不同不育系遺傳背景下表現(xiàn)也不同，12個(gè)不育系中DTYA（A2），ZBA（A8）可育花粉率達(dá)到85%以上，說(shuō)明這2個(gè)不育系在配組中育性恢復(fù)表現(xiàn)優(yōu)秀，育種中可多選用該恢復(fù)系和不育系配組選育品種，也可進(jìn)一步研究其恢復(fù)優(yōu)勢(shì)的形成和不育胞質(zhì)的遺傳背景。

3.3 “三系”雜交組合花粉育性與產(chǎn)量品質(zhì)關(guān)系

由于棉花存在恢復(fù)系源狹窄、強(qiáng)恢復(fù)系較少、恢復(fù)力較弱等因素限制，研究者在花粉發(fā)育、恢復(fù)基因定位、恢復(fù)機(jī)理等方面做了大量研究旨在提高恢復(fù)系的恢復(fù)力、育性以求最終提高棉花產(chǎn)量[22-26]。對(duì)可育花粉率與產(chǎn)量品質(zhì)關(guān)系的研究還停留在感性認(rèn)識(shí)上，深入的研究較少。在以往的研究中余鄭軍等[27]曾探索過(guò)不同時(shí)期花粉萌發(fā)率和花粉管生長(zhǎng)長(zhǎng)度的最大值與結(jié)鈴數(shù)和成鈴率的相關(guān)關(guān)系，黃雙領(lǐng)等[28]曾在研究中將不同的授粉時(shí)間和方法與成鈴率進(jìn)行分析，倪密等[29]也在研究中提到花粉可育率與自交結(jié)鈴率的變化趨勢(shì)一致，崔艷利等[30]的研究結(jié)果表明棉花籽棉產(chǎn)量與F1的多粉花率的顯性與環(huán)境互作相關(guān)達(dá)顯著水平。這些研究結(jié)果說(shuō)明:滿足授粉需求的花粉粒和適宜的環(huán)境對(duì)棉花產(chǎn)量形成起關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果表明F1可育花粉率與單株成鈴數(shù)存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，這說(shuō)明提高花粉活力在一定程度上可提高單株結(jié)鈴數(shù)，進(jìn)而提高棉花產(chǎn)量，但其與產(chǎn)量相關(guān)系數(shù)較小，還不足以直接高效準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)雜種F1的產(chǎn)量。產(chǎn)量與鈴重和單株鈴數(shù)有極顯著的相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明產(chǎn)量受其他一些產(chǎn)量相關(guān)性狀的影響更大，可育花粉率可以作為一個(gè)參考指標(biāo)指導(dǎo)篩選單株鈴數(shù)。

4 結(jié)論

棉花花粉在－20℃保存51 h，其花粉育性依然保持在88%以上且無(wú)顯著差異。“三系”雜交組合F1的花粉育性普遍低于恢復(fù)系及常規(guī)雜交種，恢復(fù)系H46恢復(fù)力較強(qiáng)，不育系DTYA和ZBA所配組合花粉育性較強(qiáng)?！叭怠彪s交F1的可育花粉率與單株成鈴數(shù)呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。