NEELAMSAH 聶小鳳 張琴

摘 要：目的 比較正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌患者宮頸脫落細胞中miR-125b表達水平差異，探討宮頸脫落細胞miR-125b表達水平檢測在HR-HPV陽性患者分層篩查中的作用及其與宮頸病變的關(guān)系。方法 采用第二代雜交捕獲技術(shù)進行HR-HPV初篩，HR-HPV陽性患者行宮頸液基薄層細胞學(xué)檢查及miR-125b檢測。液基細胞學(xué)檢查結(jié)果異常者直接陰道鏡下活檢行病理學(xué)檢查，液基細胞學(xué)檢查正常者行陰道鏡檢查，陰道鏡檢查下發(fā)現(xiàn)異常者行陰道鏡下活檢取材，余視作宮頸組織學(xué)正常，不做宮頸活檢。RT-qPCR檢測正常宮頸及不同級別宮頸病變中miR-125b表達水平，比較不同組織學(xué)分組之間的宮頸脫落細胞miR-125b表達水平，繪制ROC曲線，探討miR-125b、液基細胞學(xué)檢查在宮頸病變中的診斷作用。結(jié)果 宮頸脫落細胞miR-125b水平隨著宮頸病變程度加重逐漸升高（P<0.05）；在HR-HPV陽性患者分層篩查中，宮頸液基細胞學(xué)診斷宮頸高級別上皮內(nèi)病變的敏感性、特異性分別為64.90%、80.70%，AUC為0.728（95%CI：0.657～0.779，P<0.001）。與液基細胞學(xué)檢查相比，宮頸脫落細胞miR-125b檢測診斷宮頸高級別上皮內(nèi)病變的靈敏性、特異性更高（87.30% vs 64.90%；69.20% vs 80.70%），AUC為 0.864（95%CI：0.800～0.928，P<0.001）。結(jié)論 miR-125b水平隨著宮頸病變加重逐漸升高，檢測宮頸脫落細胞miR-125b水平可有效分流HR-HPV陽性患者，敏感性高于細胞學(xué)檢查，可能成為一種有效的分層篩查方法。

關(guān)鍵詞：宮頸病變；miR-125b；HR-HPV；宮頸癌篩查

中圖分類號：RR737.33 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.23.021

文章編號：1006-1959（2018）23-0076-04

Abstract：Objective To compare the expression levels of miR-125b in cervical exfoliated cells of normal cervix， cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer， and to explore the role of miR-125b expression in cervical exfoliated cells in stratified screening of HR-HPV positive patients. The relationship between cervical lesions. Methods The second-generation hybridization capture technique was used for HR-HPV screening. The HR-HPV-positive patients underwent cervical-based thin-layer cytology and miRNA125b detection. The results of liquid-based cytology were abnormal. The pathological examination was performed directly under biopsy. The liquid-based cytology was performed by colposcopy. The abnormalities were found under colposcopy. The colposcopy biopsy was performed. Normal， no cervical biopsy. RT-qPCR was used to detect the expression of miR-125b in normal cervical and different grades of cervical lesions. The expression levels of miR-125b in cervical exfoliated cells were compared between different histological groups. ROC curves were drawn to investigate miR-125b and liquid-based cytology. The role of diagnosis in cervical lesions. Results The level of miR-125b in cervical exfoliated cells increased with the severity of cervical lesions （P<0.05）. In the stratified screening of HR-HPV positive patients， the sensitivity of cervical liquid-based cytology in the diagnosis of high-grade intraepithelial lesions of the cervix， The specificities were 64.90% and 80.70%， respectively， and the AUC was 0.728 （95% CI： 0.657～0.779，P<0.001）. Compared with liquid-based cytology， the sensitivity and specificity of cervical exfoliated cells miR-125b for the diagnosis of high-grade intraepithelial lesions of the cervix were higher （87.30% vs 64.90%； 69.20% vs 80.70%）， and the AUC was 0.864 （95%CI： 0.800～0.928，P<0.001）. Conclusion The level of miR-125b is gradually increased with the increase of cervical lesions. The detection of miR-125b in cervical exfoliated cells can effectively divert HR-HPV positive patients， which is more sensitive than cytology and may be an effective stratified screening method.

Key words：Cervical lesions；miR-125b；HR-HPV；Cervical cancer screening

宮頸癌（cervical cancer，CC）是發(fā)展中國家女性常見的惡性腫瘤，發(fā)病率高且逐年上升[1]，其發(fā)生一般需經(jīng)歷從正常宮頸上皮到不同級別癌前病變的演變過程，平均需5～20年[2]。宮頸癌雖發(fā)病率高但其病程進展緩慢，加之宮頸位置易于被暴露和取材，因此是目前唯一可以通過篩查降低浸潤癌發(fā)生率的惡性腫瘤。宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）是宮頸癌前病變，通過篩查及時發(fā)現(xiàn)宮頸上皮內(nèi)瘤變，及時治療，是預(yù)防宮頸癌的有效措施。高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）檢測和宮頸細胞學(xué)檢查是目前最主要的兩種宮頸癌篩查方法。HPV檢測具有敏感性高，陰性預(yù)測值高，結(jié)果客觀可靠等優(yōu)點，但HPV檢測的最大局限性是陽性預(yù)測值低，因此，可能導(dǎo)致陽性婦女產(chǎn)生不必要的心理焦慮，甚至過度診療[3]。宮頸細胞學(xué)檢查具有特異性和陽性預(yù)測值高的優(yōu)點，但宮頸細胞學(xué)檢查的敏感性較低，結(jié)果判斷有較大的主觀性，依賴于經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的病理醫(yī)生[4]。因此，在HPV陽性婦女中，探索一種新的分層篩查方法具有重要意義。MicroRNAs （miRNAs）是重要的基因調(diào)節(jié)因子，在多種腫瘤中異常表達。近年來，有研究報道m(xù)iRNA可作為腫瘤診斷的生物標記物[5]。在宮頸癌發(fā)生中，miR-125b因為與E6蛋白作用的靶基因p53密切相關(guān)而受到關(guān)注[6]。miR-125b水平的升高可代表HPV病毒與宿主細胞的整合，是宮頸發(fā)生病變的標識。因此，在本課題中，我們通過檢測HR-HPV感染陽性患者宮頸脫落細胞miR-125b水平，探討miR-125b在不同宮頸病變組織中的表達情況，并進一步與宮頸細胞學(xué)檢查比較，探討其在HR-HPV陽性婦女分層篩查中的作用及價值。

1資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年10月～2017年4月至昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科進行宮頸癌篩查的就診者30000例，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。年齡25～70歲，平均年齡（37.33±5.28）歲，納入標準：①有性生活史；②研究經(jīng)患者知情同意，并簽署知情同意書。排除標準：①既往已確診患有宮頸上皮內(nèi)瘤變，宮頸癌，或其他宮頸惡性腫瘤者；②宮頸不完整，既往行宮頸部分及全部切除者；③年齡<25歲，或>70歲者；④妊娠者。

1.2方法 采用第二代雜交捕獲技術(shù)（Hybrid Capture 2，HC2）行宮頸HR-HPV初篩，HR-HPV陽性者行TCT及宮頸脫落細胞miRNA檢查，RT-qPCR方法檢測宮頸脫落細胞中miR-125b表達水平，以宮頸組織學(xué)診斷作為分組依據(jù)，比較正常宮頸組、LSIL組、HSIL組和CC組miR-125b表達水平差異。TCT結(jié)果≥ASCUS者為TCT陽性，TCT陽性者直接陰道鏡下活檢行病理學(xué)檢查；TCT陰性者行陰道鏡檢查，陰道鏡異常者陰道鏡下活檢取材。

1.2.1 HPV檢測 由經(jīng)過培訓(xùn)的婦科醫(yī)生取樣，用HPV采樣器于宮頸管內(nèi)，同一方向旋轉(zhuǎn)3周，置于樣品保存液中，4 ℃保存待檢測。采用HC2檢測高危型HPV，具體檢測方法參照生產(chǎn)商的說明。共檢測14種高危型HPV，包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68。其結(jié)果以標本的相對熒光光度值（RLU）與陽性定標的域值（CO）的比值表示，RLU/CO≥1.0為陽性，反之RLU/CO<1.0為陰性。

1.2.2 TCT檢測 由經(jīng)過培訓(xùn)的婦科醫(yī)生取樣，應(yīng)用液基細胞學(xué)取樣器，于宮頸管內(nèi)旋轉(zhuǎn) 3～5 圈，將宮頸脫落細胞保存在專用的細胞保存溶液中（Cytyc Corporation）。用液基細胞學(xué)（LBC）方法行宮頸細胞學(xué)檢查。用ThinPrep 2000 processor（Cytyc Corporation）進行液基細胞制片。由本院病理科醫(yī)生讀片并做出病理學(xué)診斷，宮頸細胞學(xué)檢測按照 TBS 分級系統(tǒng)評價標準分類，TCT 結(jié)果≥ASCUS者為TCT陽性，反之則為陰性。由2位病理學(xué)醫(yī)師獨立閱片，當診斷結(jié)果不一致時，通過討論得出一致診斷意見。

1.2.3 miR-125b檢測 由經(jīng)過培訓(xùn)的婦科醫(yī)生取樣，方法與TCT取樣相同，用宮頸細胞取樣專用軟毛刷收集宮頸脫落細胞，樣本保存于Trizol商品化試劑盒，Trizol法提取細胞中總RNA，按照試劑盒說明，應(yīng)用RT-qPCR法檢測miR-125b表達，以U6作為內(nèi)參，用2-ΔCt表示miRNA的相對表達水平，2-ΔCt數(shù)值越大表示對應(yīng)的miRNA相對表達水平越高，2-ΔCt數(shù)值越小表示對應(yīng)的miRNA相對表達水平越低。

1.2.4組織學(xué)診斷 宮頸活檢獲取的宮頸組織進行常規(guī)石蠟包埋、切片、制片，經(jīng)染色后，由2位病理學(xué)醫(yī)師獨立閱片，當診斷結(jié)果不一致時，通過討論得出一致診斷意見。診斷依據(jù)采用2014年第四版WHO女性生殖器官腫瘤分類標準，將疾病分為兩個級別：LSIL和HSIL[7]。當患者活組織檢查結(jié)果同時存在多級別宮頸病變時，則按最高級別入組。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件包完成。Mann-Whitney U檢驗分析比較正常宮頸組和LSIL組，LSIL組和HSIL組，HSIL組和CC組miR-125b表達水平差異，以（x±s）表示。構(gòu)建ROC曲線，分析TCT及miR-125b檢測在HSIL及以上病變診斷中的價值，根據(jù)最大約登指數(shù)確定miR-125b在診斷HSIL及以上病變的cut off值，比較TCT與miR-125b診斷HSIL的敏感性、特異性。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.001表示統(tǒng)計學(xué)意義極顯著。

2結(jié)果

2.1宮頸篩查及活檢情況 30000名女性參加HPV-DNA檢測的初篩，其中1140例HPV陽性，最終595例女性完成了TCT和miRNA檢測，其中90例女性TCT結(jié)果異常，505例TCT結(jié)果未見異常行陰道鏡檢查，結(jié)果正常303例、異常202例，最終共292例行陰道鏡下活檢，正常189例，LSIL 29例，HSIL 71例，CC 3例。

2.2宮頸脫落細胞miR-125b表達水平檢測結(jié)果比較 隨著宮頸病變程度的增加，miR-125b的表達水平逐漸增高，與正常組及LSIL組相比，HSIL組與CC組均增高（P<0.05），見表1。

2.3 TCT結(jié)果與宮頸病變的關(guān)系 HSIL組、CC組TCT陽性率高于LSIL組、正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 TCT結(jié)果對HISL的診斷作用 TCT結(jié)果對診斷HISL的靈敏度為64.90%，特異度為80.70%，AUC為0.728（95%CI：0.657～0.779，P<0.001），見圖1。

2.5 miR-125b對HISL的診斷作用 miR-125b對診斷HISL的靈敏度為87.30%，特異度為69.20%，AUC為0.864（95%CI：0.800～0.928，P<0.001），cut off值為0.565，見圖2。

3討論

微小RNA（ microR-NA，miRNA） 是一類內(nèi)源性的非編碼單鏈小分子RNA，長度約為 18～25個核苷酸，可與靶信使 RNA（ mRNA） 3'端非翻譯區(qū)（ 3'-UTR） 互補配對結(jié)合，進而引起靶mRNA降解或翻譯抑制，調(diào)控基因表達，是一類重要的基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，廣泛參與細胞調(diào)亡、增殖、分化等多種重要生物學(xué)過程[8]。miR-125b是p53基因的負性上游調(diào)節(jié)因子，miR-125b表達增加將導(dǎo)致p53途徑的失活，因此，導(dǎo)致p53依賴的凋亡激活降低，細胞避免G1期阻滯和DNA修復(fù)，細胞不穩(wěn)定性增加。另外，miR-125b與HPV-L2具有很高的同源性，可以參與病毒DNA合成，促進病毒繁殖，具有病毒基因組的細胞將保持存活狀態(tài)，導(dǎo)致HPV基因組重組風險的增加，導(dǎo)致癌前病變風險的增加[9]，因此，miR-125b可能用于識別HR-HPV的持續(xù)感染和宮頸病變進展的婦女。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b在宮頸癌和高級別宮頸上皮內(nèi)病變中的表達水平高于其在正常宮頸及低級別宮頸上皮內(nèi)病變中的表達，且miR-125b值隨著宮頸病變加重逐漸升高，提示miR-125b在HSIL預(yù)測中發(fā)揮一定的作用。在對HSIL預(yù)測中，miR-125b檢測與TCT相比較，診斷宮頸病變的敏感性更高（87.30% vs 64.90%），且AUC高于TCT[0.864（95%CI：0.800～0.928，P<0.001）vs 0.728（95%CI：0.657～0.779，P<0.001）]。提示miR-125b檢測作為生物標記物用于宮頸癌篩查中HPV陽性的婦女的有效分流的潛在臨床價值，值得進一步研究。本研究的不足之處為研究對象來源于醫(yī)院的婦科門診患者，而不是普通人群，這就不可避免地造成了病例構(gòu)成上的偏倚，因此，本研究的結(jié)果需要在一個大樣本普通人群中進一步研究驗證。其次，我們的研究當中最終進行宮頸活檢的有效病例僅292例，活檢病理示正常189例，LSIL 29例，HSIL 71例，CC 3例，樣本量偏少，研究結(jié)果的可靠性需要大樣本的研究加以驗證。

綜上所述，宮頸脫落細胞中miR-125b檢測在對HR-HPV陽性婦女分層篩查時的敏感性優(yōu)于宮頸細胞學(xué)檢查，進一步提高了分層篩查價值。但本研究結(jié)果是基于到醫(yī)院就診的婦女人群，且樣本量偏少，因此，我們的研究結(jié)果需要在一個較大樣本的普通人群中進一步研究證實。

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收稿日期：2018-9-28；修回日期：2018-10-09

編輯/肖婷婷