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(1.廣州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510006；2.珠江三角洲水質(zhì)安全與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州大學(xué),廣東廣州 510006；3.廣東省放射性核素污染控制與資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州大學(xué)，廣東廣州 510006；4.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院婦產(chǎn)科,四川成都 610041)

苯胺類物質(zhì)是染料、化妝品、制藥、橡膠、煤氣等工業(yè)領(lǐng)域的原料，而由于工業(yè)廢水的不合理排放對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染[1 - 3]。苯胺類物質(zhì)可通過吸入、食入或通過皮膚滲入人體，對(duì)肝臟、血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等造成嚴(yán)重?fù)p傷，還具有潛在的致癌、致突變等作用[4 - 5]。中國、美國和歐盟等均將其列入常規(guī)監(jiān)測和優(yōu)先監(jiān)測的污染物名單[2]。

目前檢測苯胺類化合物的主要分析方法有分光光度法[6]、氣相色譜法[5,7 - 8]、液相色譜法[9 - 10]、氣相色譜-質(zhì)譜法[11 - 12]、液相色譜-質(zhì)譜法[3 - 4]和電化學(xué)法[13 - 14]等。水中苯胺類物質(zhì)常用的預(yù)處理方法有固相萃取或液-液萃取法，但這兩種方法操作繁瑣、耗時(shí)，且需使用大量有毒有害的有機(jī)溶劑。分散液液微萃取(DLLME)是由REZAEE等[15]于2006年提出的一種環(huán)保、高效、簡單、經(jīng)濟(jì)的分離富集技術(shù)。目前，DLLME已被廣泛應(yīng)用于不同基質(zhì)樣品的痕量分析。本研究對(duì)DLLME過程中的各種影響因素進(jìn)行條件優(yōu)化，結(jié)合高效液相色譜法，成功將其應(yīng)用于不同水樣中苯胺、4-硝基苯胺、2-硝基苯胺和2,4-二硝基苯胺這4種物質(zhì)的同時(shí)測定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

Agilent1200型高效液相色譜儀(美國，Agilent公司)，配備二極管陣列檢測器(DAD)；TDL-4臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；氮吹儀(北京騰云博?？萍加邢薰?；電子分析天平(德國，Sartorius集團(tuán))；PB-10標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì)(德國，Sartorius集團(tuán))；超聲波清洗儀(美國，Cole-Parmer公司)；SK-1快速混勻器(江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司)；AL-01型溶劑過濾器(天津奧特塞恩斯儀器有限公司)；25μL微量進(jìn)樣器(美國，Hamilton公司)；0.45μm水性濾膜(上海安普公司)。

1000.0μg/mL的苯胺(A)、4-硝基苯胺(4-NA)的甲醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，均購自國家環(huán)境保護(hù)總局標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所，2,4-二硝基苯胺(2,4-NA)(純度≥99.0%)購自德國Dr.Ehrenstorfer化學(xué)材料公司，2-硝基苯胺(2-NA)(純度≥99.0%)購自美國AccuStandard集團(tuán)有限公司；色譜純乙腈購自上海安普公司；1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([C4MIM][PF6])離子液體購自上海成捷化學(xué)有限公司，純度99%；其他所用試劑均為分析純。

1.2 樣品處理

水樣經(jīng)0.45μm水性濾膜過濾后，用稀NaOH溶液調(diào)節(jié)試液pH值為11，接著加入NaCl固體，使其在水溶液中的濃度為0.3g/mL。取2mL水樣于5mL離心試管中(如果是加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，需加入苯胺類混合標(biāo)準(zhǔn))，快速加入一定量的三氯甲烷(萃取劑)，在快速混勻器上混勻1min后，以2000r/min的轉(zhuǎn)速離心3min；用進(jìn)樣針取出離心管底下的沉積相于內(nèi)插管中，用氮吹儀吹至近干；然后加入20μL甲醇溶解，取10μL進(jìn)行高效液相色譜分析。

1.3 色譜條件

色譜柱：AgilentExtend-C18色譜柱(250×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-水=36∶65(V/V)；流速：1.0mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10μL。苯胺和2-硝基苯胺的檢測波長為230nm，4-硝基苯胺和2,4-二硝基苯胺檢測波長為360nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

通過掃描苯胺、4-硝基苯胺、2-硝基苯胺和2,4-二硝基苯胺的紫外-可見吸收光譜，發(fā)現(xiàn)苯胺和2-硝基苯胺在波長230nm附近有最大的吸收，4-硝基苯胺在波長360nm附近有最大吸收，2,4-二硝基苯胺在波長360nm附近有個(gè)很大的吸收峰。因此，為了獲得更高的靈敏度，在DAD上設(shè)置了不同的波長進(jìn)行比較，最終選擇苯胺和2-硝基苯胺的檢測波長為230nm，4-硝基苯胺和2,4-二硝基苯胺的檢測波長為360nm。

2.2 分散液液微萃取條件的優(yōu)化

圖1 萃取劑種類對(duì)萃取效率的影響Fig.1 Effects of the type of extraction solvent on extraction efficiency

2.2.1萃取劑的選擇萃取劑是影響分散液液微萃取萃取效果的重要因素。本實(shí)驗(yàn)分別選取了1,2-二氯乙烷、三氯甲烷、四氯化碳、二氯甲烷以及離子液體[C4MIM][PF6]這5種物質(zhì)作為分離富集水樣中4種目標(biāo)苯胺類物質(zhì)的萃取劑，結(jié)果見圖1。從圖中可以看出三氯甲烷和1，2-二氯乙烷的萃取效果較佳，但前者的毒性低于后者。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇三氯甲烷作為萃取劑。

2.2.2萃取劑體積的選擇萃取劑體積越大，對(duì)目標(biāo)組分的萃取量越大，但萃取劑體積過大會(huì)造成目標(biāo)組分濃度的稀釋，從而降低萃取效率。本實(shí)驗(yàn)考察了萃取劑三氯甲烷體積分別為20、30、40、50、60、70、80 μL對(duì)萃取效率的影響，結(jié)果見圖2。當(dāng)萃取劑三氯甲烷體積從20 μL增加到60 μL時(shí)，萃取效率逐漸增大，到體積60 μL時(shí)，萃取效率最高，繼續(xù)加大萃取劑的體積，萃取效率反而有所降低。因此，選取60 μL作為最佳萃取劑體積。

2.2.3水樣pH值的影響實(shí)驗(yàn)考察了水樣pH值在6至12對(duì)萃取效率的影響(圖3)。當(dāng)pH值從6增加到10時(shí)，三氯甲烷對(duì)苯胺類化合物的萃取效率隨著pH值的增大而增大；pH值在10～12之間，萃取效率無明顯變化。這是因?yàn)樵趐H值為10～12時(shí)，苯胺類物質(zhì)主要以分子形式存在，在水中的溶解度相對(duì)較小，有利于被三氯甲烷萃取。因此，為了減少實(shí)驗(yàn)的誤差，本實(shí)驗(yàn)調(diào)節(jié)水溶液的pH值為11。

圖2 萃取劑體積對(duì)萃取效率的影響Fig.2 Effect of the volume of extraction solvent on extraction efficiency

圖3 溶液pH值對(duì)萃取效率的影響Fig.3 Effect of pH value of solution on extraction efficiency

圖4 NaCl濃度對(duì)萃取效率的影響Fig.4 Effect of NaCl concentration on extraction efficiency

2.2.4鹽度的影響鹽效應(yīng)對(duì)萃取的影響有雙方面：(1)鹽析作用，增加溶液的離子強(qiáng)度，降低目標(biāo)組分在溶液中的溶解度，提高萃取效率；(2)樣品中的極性物質(zhì)與鹽離子的靜電作用，會(huì)降低萃取效率。本實(shí)驗(yàn)考察了水樣中0、0.1、0.2、0.3 g/mL的NaCl對(duì)苯胺類物質(zhì)萃取效率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。三氯甲烷萃取苯胺類物質(zhì)，鹽析效應(yīng)占主導(dǎo)地位，即隨著鹽度的增加，萃取效率也在增加。因此，本實(shí)驗(yàn)采用0.3 g/mL的NaCl來調(diào)節(jié)水樣的鹽度。

2.3 方法的評(píng)價(jià)

2.3.1方法的線性范圍、檢出限和重現(xiàn)性以優(yōu)化后含鹽水溶液(pH=11)為介質(zhì)，配制一系列不同濃度苯胺、4-硝基苯胺、2-硝基苯胺和2,4-二硝基苯胺的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化的條件下進(jìn)行分散液-液微萃取/高效液相色譜法測定，每個(gè)濃度至少重復(fù)3次。4種目標(biāo)苯胺類物質(zhì)在2～1 000 μg/L濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)為0.9991～0.9997；以3倍信噪比(S/N=3)得出苯胺類物質(zhì)的檢出限為0.3～0.5 μg/L。對(duì)濃度為10 μg/L苯胺類物質(zhì)溶液進(jìn)行6次的平行測定，得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.2%～5.3%，重現(xiàn)性良好。

表1 4種苯胺的線性范圍、線性方程、檢出限及精密度

y:peak area;x:mass concentration,μg/L.

2.3.2樣品分析及加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，測定了實(shí)驗(yàn)室自來水、珠江江水(廣州大學(xué)河段)、廣州瀝滘污水處理廠的污水和廣州南沙海水中的4種目標(biāo)苯胺類物質(zhì)，他們的含量均低于本方法的檢出限。為了考察基質(zhì)效應(yīng)的影響，對(duì)這些實(shí)際水樣進(jìn)行兩個(gè)濃度(10 μg/L和100 μg/L)的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，測定其回收率，結(jié)果見表2。從表中可知實(shí)際水樣的加標(biāo)回收率在87.6%～101.8%之間，RSD為4.1%～6.5%，說明受基質(zhì)效應(yīng)的影響小，重現(xiàn)性良好。圖5為蒸餾水加標(biāo)、污水空白和加標(biāo)水樣的分散液-液微萃取后的色譜圖。

2.4 本方法與其他方法的比較

將本實(shí)驗(yàn)所建立的方法與其他方法進(jìn)行比較，見表3。雖說近幾年有方法采用直接進(jìn)樣測定水中苯胺類物質(zhì)，但需采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法才能達(dá)到比較好的靈敏度[3 - 4,17]。而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，由于使用的儀器貴，目前還不普及。陳昀[20]使用分散液-液微萃取的方法富集環(huán)境水樣中的硝基苯胺類物質(zhì)，方法的檢出限跟本方法類似，使用了75 μL三氯甲烷做萃取劑，1 mL的乙腈做分散劑，采用3次反復(fù)抽取注射的方式來達(dá)到萃取的效果，回收率只有53.6%，沒有本方法好，使用的有機(jī)溶劑也比本方法多。我國現(xiàn)行實(shí)施的《污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》測定苯胺的方法是N-(1-萘基)乙二胺偶氮分光光度法，此方法測定的是芳香族伯胺類化合物的總和，不是具體的各個(gè)苯胺類化合物的含量，水樣的體積為25 mL，對(duì)于苯胺最低檢出濃度為30 μg/L[21 - 22]?！兜乇硭h(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中測定苯胺的方法是氣相色譜-氫火焰離子化檢測法(GC-FID)，樣品的前處理使用GDX-502高分子微球吸附10 L水中微量苯胺，用二氯乙烷洗脫，方法的最低檢測濃度為2 μg/L[23 - 24]，但此法操作繁瑣、耗時(shí)、所需水樣量大。

圖5 蒸餾水加標(biāo)(a)、 污水空白(b)和加標(biāo)水樣(c)的色譜圖Fig.5 Chromatograms of distilled water spiked with the anilines(100 μg/L)(a)，waste water(b) and waste water spiked with the anilines(100 μg/L)(c)1.aniline;2.4-nitroaniline;3.2-nitroaniline;4.2,4-dinitroaniline.

AnalyteSpiked(μg/L)Tap waterRiver waterWaste water Sea waterRecovery(%)RSD (%)Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD (%)Recovery(%)RSD (%)A10100.66.390.94.494.54.594.45.410093.65.899.55.590.84.989.56.12-NA1099.65.891.74.296.25.087.66.010092.35.397.94.197.94.790.25.84-NA1092.56.091.24.696.36.293.26.1100101.85.394.25.895.45.694.95.72,4-NA1096.76.192.35.292.45.590.16.510097.34.995.35.497.45.394.86.3

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法，根據(jù)4種苯胺類物質(zhì)的最大吸收波長來分別設(shè)置檢測波長從而提高儀器檢測的靈敏度。另外，本實(shí)驗(yàn)采用分散液-液微萃取的方法分離富集水樣中苯胺類物質(zhì)，所需萃取劑三氯甲烷只要60 μL，不需要分散劑，水樣也只需2 mL，萃取快速，操作簡單，靈敏度和重現(xiàn)性都得到了較好的結(jié)果，滿足《污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》[21]和《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[23]中規(guī)定的苯胺一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)最高限量值分別為1 000、100 μg/L的要求，適用于污水及地表水源中苯胺、4-硝基苯胺，2-硝基苯胺和2,4二硝基苯胺的測定。

表3 本方法與其他測定苯胺類物質(zhì)方法的比較

(續(xù)表3)

MethodRef.Linear range(μg/L)Extraction time(min)Sample volume(mL)Recovery(%)RSD(%)Detection of limit(μg/L)A2-NA4-NA2,4-NATC-IL-DLLME-UPLC-MS/MS j[18]0.5-503887.4-95.78.3-13.60.005---DI-HPLC-FLDk[9]50-200 000--91-109.91.6518---OL-SPE-HPLCl[10]--56-98-0.50.10.2-UA-IL-DLLME-HPLCm[19]100-1 500121090.5-1130.3-4.20.5-73-ECDn[13] 931-93 100--96-1013.83563---DLLME-HPLC o[20]2-200-553.6-1111.1-5.8-0.140.210.26Our method2-1 0001284.9-95.84.0-6.90.30.50.30.5

aSimultaneous derivatization-dispersive liquid liquid microextraction-GC-FID;bSimultaneous derivatization-ultrasound assisted emulsification microextraction-GC-FID;cNeedle trap-GC-NPD;dMicrowave assisted-headspace-solid phase microextraction-GC-FID;eHeadspace-solid phase microextraction-GC-MS;fSolid phase microextraction-GC-MS;gDirect injection-LC-MS/MS;hDirect injection-HPLC-MS/MS;iDirect injection-LC-MS/MS;jTemperature controlled-ionic liquid-dispersive liquid liquid microextraction-UPLC-MS/MS;kDirect injection-HPLC-FLD;lOn line-solid phase extraction-HPLC;mUltrasound assisted-ionic liquid-dispersive liquid liquid microextraction-HPLC;nElectrochemical detection;oDispersive liquid liquid microextraction-HPLC.

3 結(jié)論

采用了分散液-液微萃取/高效液相色譜-二極管陣列檢測法，建立了測定水樣中苯胺、4-硝基苯胺、2-硝基苯胺和2,4-二硝基苯胺的分析方法。該方法操作簡單、所需溶劑少、環(huán)保、回收率高、檢出限低、重現(xiàn)性好，適合用于實(shí)際水樣中這4種苯胺類物質(zhì)的分析檢測。