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(重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶渝北 400020)

喹諾酮類抗生素是一類人畜通用的藥物，因其具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)及與其他抗菌藥物無交叉耐藥性等特點，被廣泛應(yīng)用于人和動物疾病的治療。但近十幾年來，濫用及超量使用抗生素類藥物的現(xiàn)象普遍存在，喹諾酮類藥物殘留問題也越來越引起人們的關(guān)注[1]。聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑專家聯(lián)席委員會、歐盟都已制定了多種喹諾酮類藥物在動物組織中的最高殘留限量。我國農(nóng)業(yè)部235公告明確規(guī)定了產(chǎn)蛋雞中是禁止使用的[2],但為了追求高額利益，在養(yǎng)殖期間隨意添加、不遵守休藥期、違法濫用藥物使得喹諾酮類藥物在雞蛋的殘留問題越來越嚴(yán)重。因此，有必要建立一種快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏的分析方法來檢測雞蛋中的喹諾酮類藥物殘留。目前，喹諾酮藥物類殘留的分析方法主要有酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)、高效液相色譜法(HPLC)和液相色譜-質(zhì)譜分析法(LC-MS)[3 - 6]。前處理方面，大多數(shù)都是用磷酸鹽緩沖溶液提取后加正己烷脫脂，或者用乙腈沉淀蛋白質(zhì)和正己烷脫脂[7 - 9]。我國國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T20366-2006)和(GB/T21312-2007)推薦的檢測方法中，前者需要大量提取液提取，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后凈化，耗時長，不適合大批量樣品的日常檢測；后者用緩沖鹽溶液提取，再用傳統(tǒng)的固像萃取小柱凈化。但雞蛋中含有大量脂類、氨基酸及蛋白質(zhì)等干擾物，樣品經(jīng)緩沖鹽溶液提取之后的提取液較渾濁，不利于凈化，進(jìn)而影響結(jié)果準(zhǔn)確度。

本實驗采用一種新型反相固相萃取watersOasisPRiMEHLB小柱凈化。PRiMEHLB小柱是在水可浸潤性填料HLB基礎(chǔ)上進(jìn)行的創(chuàng)新和設(shè)計，不需要活化、平衡，直接將基質(zhì)干擾吸附在填料內(nèi)，待測物過濾到收集瓶中，無需洗脫，簡化了操作步驟，節(jié)省了前處理時間。David等[10 - 11]用PRiMEHLB固相萃取柱建立了牛奶中多種獸藥同時檢測的方法，能有效去除牛奶中大部分的基質(zhì)干擾，同時回收率和精密度良好;李洪斌等[12 - 14]將PRiMEHLB用于獸藥殘留的凈化也取得了很好的效果。目前雞蛋中喹諾酮類藥物殘留研究的報道較多[15 - 18]，大多用傳統(tǒng)方法提取，用高效液相色譜-熒光檢測法測定，外標(biāo)法定量，采用內(nèi)標(biāo)法的較少[19]。傳統(tǒng)的提取方法存在提取效率的問題；外標(biāo)法定量有很強(qiáng)的基質(zhì)干擾；高效液相色譜法對于多種物質(zhì)的檢測難以解決分離問題。本文在前人的研究基礎(chǔ)上，建立了新型固相萃取-超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)測定，內(nèi)標(biāo)法定量，快速測定雞蛋中的10種喹諾酮類藥物殘留的方法。UPLC-MS/MS法具有高通量、高靈敏度、高選擇性等優(yōu)點，能很好的解決分離問題，同時內(nèi)標(biāo)法定量又能有效校正基質(zhì)效應(yīng)等引起的誤差，提高分析效率。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

THERMOTSQENDURA三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國，賽默飛公司)；THERMOUltimate3000超高效液相色譜儀(美國，賽默飛公司)；IKAVORTEXGENIUS3(德國，IKA公司)；MD200-2氮吹儀(杭州奧盛儀器設(shè)備有限公司)；WatersOasisPRiMEHLB固相萃取柱(60mg/3cc,美國Waters公司)。

恩諾沙星，環(huán)丙沙星，達(dá)氟沙星，沙拉沙星，諾氟沙星,氟羅沙星，雙氟沙星，氧氟沙星，司帕沙星，氟甲喹(所有標(biāo)準(zhǔn)品均來自德國Dr.E公司)，氘代諾氟沙星、氘代環(huán)丙沙星、氘代恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品(德國DR.E公司)。標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：分別稱取10mg各標(biāo)準(zhǔn)品，置于10mL棕色容量瓶中，加甲酸200μL,用甲醇溶解定容至刻度，分別配制成1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，-20℃冰箱避光保存。吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用流動相稀釋配成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按需要用初始流動相稀釋成相應(yīng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別稱取氘代諾氟沙星、氘代環(huán)丙沙星、氘代恩諾沙星內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品各5mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成0.5mg/mL的同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液。準(zhǔn)確吸取內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用甲醇稀釋配成1.0μg/mL內(nèi)標(biāo)工作溶液，避光4℃保存，有效期一個月。乙腈、甲醇、正己烷(色譜純，德國Sigma公司)；NaCl、無水Na2SO4(重慶川東化工有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1前處理方法準(zhǔn)確稱取勻質(zhì)試樣5.00 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液50 μL，加入2 g NaCl，渦旋混合30 s，加入酸化乙腈10 mL，渦旋混合1 min，超聲提取10 min，8 000 r/min離心5 min。取上清液于另一50 mL離心管中，殘渣中加10 mL酸化乙腈，重復(fù)提取一次，合并兩次提取液。取10 mL上清液過PRiME HLB小柱，保持1 mL/min的流速，收集全部流出液，40 ℃氮氣吹干，再加1 mL 5%甲醇渦旋溶解殘留物，過0.22 μm微孔濾膜，供UPLC-MS/MS測定，內(nèi)標(biāo)法定量。其中氟羅沙星、氧氟沙星、諾氟沙星以氘代諾氟沙星為內(nèi)標(biāo)；達(dá)氟沙星、雙氟沙星和環(huán)丙沙星以氘代環(huán)丙沙星為內(nèi)標(biāo)；恩諾沙星、沙拉沙星、司帕沙星、氟甲喹以氘代恩諾沙星為內(nèi)標(biāo)。

1.2.2液相色譜-質(zhì)譜條件色譜柱：Hypersil GOLD柱(50×2.1 mm,1.9 μm)；流動相：A：0.1%甲酸水溶液，B:乙腈,流速：0.4 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：5 μL。梯度洗脫程序:0～0.5 min,90%A;0.5～1.0,90%～50%A;1.0～1.5,50%～10%A;1.5～3.0,10%～90%A;3.0～4.0,90%A。離子化模式：電噴霧正離子模式(ESI+)；噴霧電壓：3 500 V;離子傳輸管溫度：350 ℃；蒸發(fā)溫度：300 ℃。選擇多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 各化合物質(zhì)譜參數(shù)

(續(xù)表1)

CompoundPrecursor(m/z)Product(m/z)RF lens(V)Collision energy(eV)Sarafloxacin386.1299.114428.1386.1342.014418.6Difloxacin400.3299.016728.7400.3356.116717.1Fleroxacin370.0269.115725.0370.0326.015716.0Ofoxacin362.2261.215027.0362.2318.315018.0Sparfloxacin393.1292.116523.7393.1349.116517.1Flumequin262.1202.116336.1262.1244.016320.1Enrofloxacin-D5365.1321.115718.0Ciprofloxacin-D8340.1322.114621.0Norfloxacin-D5325.1302.113921.1

2 結(jié)果與討論

2.1 提取液的優(yōu)化

喹諾酮結(jié)構(gòu)上有羧基和哌嗪基，具有酸堿兩性，易溶于酸性或堿性溶劑，乙腈屬于強(qiáng)極性溶劑，加酸或堿能增加溶劑的極性，影響提取效率[20]。本實驗中比較了不同濃度的酸化乙腈(0.1%、1%和5%甲酸乙腈)提取目標(biāo)化合物，并沉淀蛋白，結(jié)果見圖1。從圖中可以看出，用1%甲酸乙腈提取樣品，10種目標(biāo)物的回收率均能達(dá)到88%以上，效果較好。而用0.1%和5%甲酸乙腈處理樣品，10種目標(biāo)物的回收率差別較大，個別藥物回收率較低。一部分原因可能是因為酸度太低，蛋白沉淀不夠完全，導(dǎo)致離心時不夠澄清，過小柱會有所損失，進(jìn)而影響回收率；另一方面，酸度太高可能影響離子化效率，使樣品的溶解性減弱。因此，綜合考慮實驗中選取1%甲酸乙腈來提取樣品，沉淀蛋白。

2.2 前處理條件優(yōu)化

比較了樣品提取時分別添加NaCl、無水Na2SO4和正己烷的提取效果，見圖2。從實驗結(jié)果來看，添加NaCl的樣品回收率在74%～110%之間；添加無水Na2SO4的樣品回收率在62%～101%之間；添加正己烷的樣品回收率在62%～108%之間(加標(biāo)量1 μg/kg)，都符合國家標(biāo)準(zhǔn)(GBT 27404-2008)中對回收率的規(guī)定范圍。但是在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，添加NaCl能沉淀部分蛋白，離心后的樣品很清澈，方便后續(xù)凈化上機(jī)；添加無水Na2SO4和正己烷的樣品過柱之后相對要渾濁，給后續(xù)凈化帶來一定的難度。實驗選擇加入NaCl，再加入甲酸乙腈來沉淀蛋白。

圖1 不同濃度甲酸乙腈提取液對喹諾酮類藥物回收率的影響Fig.1 Effect of concentrations of formic acid acetonitrile on the recoveries of 10 quinolones

圖2 不同鹽類對喹諾酮類藥物回收率的影響Fig.2 Salt effect on the recoveries of 10 quinolones

2.3 凈化方式的優(yōu)化

雞蛋中含有大量的磷脂，極大地干擾了目標(biāo)化合物的分析，損耗色譜柱壽命，以及增加儀器的維護(hù)成本。磷脂的主要成分是磷脂酰膽堿(PC)，磷脂酰膽堿是一種兩性分子，由親水的頭部和疏水的尾部組成。極性頭部基團(tuán)易斷裂，正離子模式下易產(chǎn)生特征碎片離子m/z184[21 - 23]。因此，本實驗質(zhì)譜方法中加入了監(jiān)測184/184的MRM通道，即可實現(xiàn)對樣品中磷脂含量的監(jiān)測。

圖3為凈化前后的磷脂酰膽堿碎片離子的色譜圖。從圖中可以看出凈化后的樣品磷脂含量明顯低于未凈化的樣品。說明PRiME HLB 小柱能有效去除磷脂等干擾物，同時也提高了凈化效率，節(jié)約前處理時間。所以，本實驗選擇用PRiME HLB 固相萃取小柱凈化后再上機(jī)測定。

圖3 空白雞蛋樣品中磷脂離子色譜圖 Fig.3 Chromatograms of PC product ion in egg sample (a) not cleaned up；(b) cleaned up by PRiME HLB.

2.4 流動相的優(yōu)化

因喹諾酮類是酸堿兩性物質(zhì)，直接用乙腈和水做流動相，色譜峰容易拖尾。因其是正離子模式，可向流動相中加酸以增強(qiáng)其保留能力，考慮到質(zhì)譜對流動相的特殊要求，本實驗中以乙腈和0.1%甲酸水溶液作為流動相，可大大提高靈敏度，且色譜峰形更好。實驗優(yōu)化后的流動相及梯度洗脫程度見1.2.2項。

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1線性方程及相關(guān)系數(shù)以樣品濃度和各組分色譜峰面積作圖，得到10種目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性方程和線性相關(guān)系數(shù)見表2。在濃度0.5～50 ng/mL范圍內(nèi)，10種喹諾酮類藥物的峰面積和濃度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程和相關(guān)系數(shù)

2.5.2回收率、精密度及基質(zhì)效應(yīng)我國農(nóng)業(yè)部235號公告對幾種藥物的限量標(biāo)準(zhǔn)為：恩諾沙星、環(huán)丙沙星在雞蛋中禁用，其他幾種未規(guī)定限量標(biāo)準(zhǔn)。參考在其他肌肉組織中的限量，其中限量最低的為沙拉沙星(10.0 μg/kg)。本實驗分別進(jìn)行了0.5、5、10 μg/kg三水平加標(biāo)，按照1.2.1樣品前處理方法進(jìn)行處理，上機(jī)測定，每個添加水平進(jìn)行6次平行測定。結(jié)果如表3 所示，回收率范圍為 83.5%～102.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.7%～11.5%(n=6)，重復(fù)性良好。方法的準(zhǔn)確度及精密度滿足國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 27404-2008)《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》的技術(shù)要求。

2.5.3方法檢出限以信噪比(S/N)=3計算檢出限。當(dāng)進(jìn)樣量為5 μL時，雞蛋中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、沙拉沙星、諾氟沙星、氟羅沙星、氧氟沙星、司帕沙星、雙氟沙星、氟甲喹的檢出限分別為：0.026、0.0038、0.0044、0.0023、0.0036、0.033、0.011、0.0054、0.033、0.016 μg/kg。方法靈敏度高，能滿足實際樣品檢測需要。

2.6 方法運用

采用所建立的方法對市售的柴雞蛋、鮮雞蛋、土雞蛋、綠殼雞蛋和白殼雞蛋5種雞蛋樣品均購買于超市，共30組樣品進(jìn)行取樣檢測。其中3份樣品有檢出，分別檢出恩諾沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星。其中，恩諾沙星含量為2.6 μg/kg；環(huán)丙沙星含量分別為3.4 μg/kg；諾氟沙星含量為2.5 μg/kg。目前國家監(jiān)督抽檢中只規(guī)定了恩諾沙星和環(huán)丙沙星為必檢項目，但是從實驗結(jié)果來看，其他幾種藥物也有必要納入到監(jiān)測范圍，以便于進(jìn)一步加強(qiáng)監(jiān)測力度，確保老百姓舌尖上的安全。

表3 不同加標(biāo)濃度喹諾酮類藥物在雞蛋樣品中的回收率(n=6)

3 結(jié)論

本文研究建立了雞蛋中10種喹諾酮類抗生素殘留量的固相萃取UPLC-MS/MS測定方法。實驗表明，該方法測定10種喹諾酮類藥物在濃度0.5～50 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性，分析結(jié)果滿足喹諾酮類藥物殘留相關(guān)法規(guī)的限量要求和回收率、精密度要求。而且與目前相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)及其它文獻(xiàn)報道的方法相比，既確保了準(zhǔn)確性和精密度，又簡化了前處理，適合大批量的日常分析檢測，為建立同時快速測定獸藥殘留的研究提供了數(shù)據(jù)和支持。