胡宇玲，厲海笛，王會芳，賈長虹，常麗新，唐紅梅

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鹽地堿蓬內(nèi)生菌的分離及功能酶的檢測

胡宇玲1，厲海笛1，王會芳2，賈長虹1，常麗新1，唐紅梅1

（1. 華北理工大學 生命科學學院，河北 唐山 063210；2. 天津市薊州區(qū)漁陽中學 化學教研室，天津 301900）

為研究鹽地堿蓬的內(nèi)生菌，采集河北省唐山市曹妃甸地區(qū)的鹽地堿蓬進行內(nèi)生菌的分離、純化，并觀察其菌落形態(tài)、檢測產(chǎn)功能酶的菌株。最終從鹽地堿蓬的根、莖、葉共分離得到內(nèi)生菌16株，其中內(nèi)生細菌10株、內(nèi)生真菌6株；篩選出產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶、蛋白酶的內(nèi)生細菌和真菌分別為5株和4株、3株和1株、3株和3株、2株和2株。

鹽地堿蓬；內(nèi)生菌；分離；功能酶

植物內(nèi)生菌是指來自于外表健康的植物體內(nèi)的真菌或細菌，是植物體內(nèi)小生境下所有微生物的總和。內(nèi)生菌定居在植物體內(nèi)，與宿主之間形成互利互惠的共生或者互生關(guān)系。這種緊密的生存模式既有利于內(nèi)生菌獲取營養(yǎng)和穩(wěn)定的生活環(huán)境，又有利于植物抗病、耐旱、固氮等，甚至會產(chǎn)生聯(lián)合代謝產(chǎn)物[1]。這些聯(lián)合代謝產(chǎn)物是內(nèi)生菌與植物互相作用產(chǎn)生的次生代謝物，往往具有新的生物學活性，可作為合成藥物的前體化合物。由于內(nèi)生菌在農(nóng)林業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用，因此人們越來越重視對植物內(nèi)生菌生理、生態(tài)、遺傳以及產(chǎn)生物活性物質(zhì)能力等性質(zhì)的研究。

鹽地堿蓬（），又名翅堿蓬、黃須菜，屬于藜科堿蓬屬，是典型的草本鹽生植物，廣泛生長在我國華北、東北、西北等鹽堿土壤。由于鹽地堿蓬富含Vc、微量元素、黃酮類化合物、不飽和脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)[2,3]，食用價值較高。因其是肉質(zhì)吸鹽植物，鹽分越高的地方生長越茂盛，使鹽堿化土地脫鹽，可用于改良土壤和恢復(fù)生態(tài)環(huán)境[4,5]。鹽地堿蓬生長在高鹽堿極端條件下，其內(nèi)生菌也應(yīng)具有特殊的生理生化性質(zhì)。本文對唐山曹妃甸地區(qū)鹽地堿蓬進行內(nèi)生細菌和真菌的分離純化，并對它們進行了形態(tài)學觀察和功能酶的篩選，為深入研究鹽地堿蓬內(nèi)生菌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集

2014年10月在唐山市曹妃甸區(qū)鹽堿地采集的整株鹽地堿蓬裝于無菌牛皮紙袋中密封，實驗室4 ℃保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

分離內(nèi)生細菌和內(nèi)生真菌，分別采用添加兩性霉素B的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和添加青霉素、鏈霉素的PDA培養(yǎng)基。鑒定內(nèi)生細菌或內(nèi)生真菌產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶和蛋白酶所用的培養(yǎng)基是在原培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別添加1%可溶性淀粉、1%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、1% Tween 20和1%脫脂牛奶等成分。所有培養(yǎng)基均由華北理工大學生命科學學院中心實驗室配置。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生菌的分離和純化

分別配置上述兩種培養(yǎng)基，121 ℃下滅菌20 min，倒平板待用。新鮮的樣品先用流水沖洗，去除表面泥土；再用75%的酒精浸泡1 min，無菌水沖洗3~4次；然后用0.1%升汞浸泡5 min，無菌水沖洗3~4次；接下來用無菌刀片將鹽地堿蓬根、莖、葉切成0.5 cm~1 cm小段，之后用無菌鑷子將組織塊分別置于兩種培養(yǎng)基表面，最后將培養(yǎng)皿置于25℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)，每日觀察。截取最后一次清洗液100 μL分別涂布在兩種培養(yǎng)基平板上，檢驗樣品表面消毒是否徹底。

將分離到的內(nèi)生細菌和內(nèi)生真菌分別在兩種培養(yǎng)基的平板上劃線培養(yǎng)，直至得到單菌落。挑取單菌落接種到斜面培養(yǎng)后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌落和菌體的形態(tài)學觀察

將分離到的內(nèi)生細菌和內(nèi)生真菌分別劃線接種在兩種培養(yǎng)基的平板上，25℃培養(yǎng)72 h后，觀察菌落形態(tài)、大小、顏色、透明程度、邊緣和突起等特征。挑取少量細菌，稀釋、固定、革蘭氏染色，在油鏡下觀察細菌的形狀和染色特征。

1.2.3 產(chǎn)功能酶菌株的檢測

淀粉酶：菌株接種到含有1%可溶性淀粉的培養(yǎng)平板，25 ℃培養(yǎng)48 h后，碘液均勻鋪于平板上，菌落周圍若有透明圈說明該菌株可產(chǎn)生淀粉酶，為產(chǎn)淀粉酶陽菌。反之為陰性。

纖維素酶：菌株接種至添加1% CMC-Na的培養(yǎng)平板，25 ℃培養(yǎng)48 h后，0.1%的剛果紅水溶液浸染30 min，菌落周圍出現(xiàn)透明圈的為產(chǎn)纖維素酶陽性菌。反之為陰性。

脂肪酶：菌株接種到添加1% Tween 20的培養(yǎng)平板，25 ℃培養(yǎng)48 h，菌落周圍若有白色暈圈，說明該菌株可代謝產(chǎn)生脂肪酶，為產(chǎn)脂肪酶陽性菌。反之為陰性。

蛋白酶：菌株接種到含有1%脫脂牛奶的培養(yǎng)平板，25 ℃培養(yǎng)48 h，菌落周圍若有白色暈圈，證明該菌株可代謝產(chǎn)生蛋白酶，為產(chǎn)蛋白酶陽性菌。反之為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位分離到的內(nèi)生菌數(shù)量

在兩種不同培養(yǎng)基中，可從鹽地堿蓬的不同組織分離得到上百株微生物，且每塊組織周圍都生長菌落，但有些菌落特征相同或相似，因此根據(jù)菌落大小、顏色、形狀等特點，對分離到的內(nèi)生菌進行分類，共分離出內(nèi)生菌16株，其中細菌10株，真菌6株。在堿蓬根、莖、葉中分別分離出細菌2、5、3株，真菌1、3、2株。分離的總內(nèi)生菌數(shù)量莖中最多，根部最少。由此可見，鹽地堿蓬不同部位內(nèi)生菌的數(shù)量并不相同，內(nèi)生菌生存部位具有特異性。

2.2 形態(tài)學特征

將分離到的內(nèi)生細菌依次編號為A1~A10，內(nèi)生真菌依次編號為B1~B6。

2.2.1 內(nèi)生細菌的形態(tài)特征

如表1所示，堿蓬內(nèi)生細菌多為桿狀的革蘭氏陰性菌，菌落圓形，呈現(xiàn)乳白色和黃色，多數(shù)不透明。

表1 細菌菌落和菌體特征

2.2.2 內(nèi)生真菌的形態(tài)特征

表2 真菌菌落特征

真菌的菌落較大，多數(shù)為圓形，呈白色或者乳白色，正反面、邊緣和中間的顏色一般不同，有較豐富的菌絲，如表2所示。

2.3 檢測菌株所產(chǎn)的功能酶

從表3可知，產(chǎn)淀粉酶菌株共有9株，其中細菌5株，真菌4株。產(chǎn)纖維素酶的菌株共4株，其中細菌3株，真菌1株。產(chǎn)脂肪酶的菌株共6株，其中細菌3株，真菌3株。產(chǎn)蛋白酶的菌株共4株，其中細菌2株，真菌2株?？梢姼骶戤a(chǎn)酶能力并不完全一致。

表3 菌株產(chǎn)各種功能酶

3 討論

植物內(nèi)生菌普通存在于幾乎所有類群的植物體內(nèi)，數(shù)目巨大、種類多樣，有人估計在自然界，植物內(nèi)生菌的種類高達100萬種以上[1]。本研究從鹽地堿蓬體內(nèi)只粗略分離到16種內(nèi)生菌，與其他植物分離到內(nèi)生菌的數(shù)量相比，數(shù)量較少[6]。堿蓬作為真鹽植物，體內(nèi)鹽含量相對較高，而絕大多數(shù)微生物生長在低鹽環(huán)境中，因此推測鹽地堿蓬內(nèi)生菌屬于極端微生物之一的嗜鹽微生物，種類和數(shù)量相對比較少。由于嗜鹽微生物更容易在無鹽培養(yǎng)基中生長[7]，為了獲取較多的微生物，本研究選用非高鹽培養(yǎng)基進行微生物的分離純化。這些堿蓬內(nèi)生菌提高了我們對生物多樣性的理解與認知，這些內(nèi)生菌的具體物種還需要分子生物學的方法進行鑒定。

鹽地堿蓬具有適應(yīng)鹽堿土地惡劣環(huán)境的能力，其內(nèi)生菌體內(nèi)的酶也必然存在特殊的作用機制。本研究只進行了纖維素酶、脂肪酶、蛋白酶等酶的篩選，還可以深入研究其他酶，尤其是對鹽比較敏感的酶，可為酶在生產(chǎn)實際中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

[1] 王志偉,紀燕玲,陳永敢.植物內(nèi)生菌研究及其科學意義[J].微生物學通報,2015,42(2):349-363.

[2] 周浩.野生蔬菜鹽地堿蓬的營養(yǎng)成分分析及評價[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2009,37(29):14107-14108.

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Enzyme Screening and Isolation ofEndophytes

HU Yu-ling1, LI Hai-di1, WANG Hui-fang2, JIA Chang-hong1, CHANG Li-xin1, TANG Hong-mei1

(1. College of Life Sciences, North China University of Science and Technology, Tangshan 063210, China; 2. Yuyang Junior High School in Jizhou District, Tianjin 301900, China)

To study the kinds of entophyte of, entophyte was isolated from the plants where they were collected from Caofeidian beach Tangshan City Hebei Province. Their morphological features were observed, and producing enzymes were tested. As a result, 16 strains of entophyte were isolated from the roots, stems and leaves of the plant, including 10 strains of entophytic bacteria and 6 strains of entophytic fungi. The important enzymes from these entophyte are screened subsequently. The results show that 5 strains of entophytic bacteria and 4 strains of entophytic fungi produced amylase, 3 strains of entophytic bacteria and 1 strain of entophytic fungi produced cellulose, 3 strains of entophytic bacteria and 3 strains of entophytic fungi produced lipase, 2 strains of entophytic bacteria and 2 strains of entophytic fungi produced protease. The experiment provides a reliable theoretical basis in entophytic diversity and producing enzymes.

entophyte; isolation; enzyme

Q935

A

1009-9115(2018)06-0070-03

10.3969/j.issn.1009-9115.2018.06.016

華北理工大學大學生創(chuàng)新實驗項目（X2014119）

2017-04-19

2018-09-20

胡宇玲（1993-），女，新疆烏魯木齊人，研究方向為微生物學與分子生物學研究。

唐紅梅（1973-），女，遼寧莊河人，博士，副教授，研究方向為微生物學與分子生物學研究。

（責任編輯、校對：李春香）