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        菌株Serratia sp.PW7不同定殖方式對(duì)黑麥草中芘污染去除及其內(nèi)生菌群的影響

        2018-12-25 11:13:44左尚武王萬清王金嵩權(quán)成偉朱雪竹
        關(guān)鍵詞:定殖黑麥草內(nèi)生

        李 爽,左尚武,王萬清,王金嵩,權(quán)成偉,朱雪竹*

        (1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,南京 210095;2.北京科技大學(xué)天津?qū)W院,天津 301830)

        多環(huán)芳烴(PAHs)是一類環(huán)境中廣泛存在的持久性有機(jī)污染物,具有致癌性、致畸性和致突變性,因其具有強(qiáng)疏水性和較高的辛醇-水分配系數(shù),易于被植物吸收積累并通過食物鏈富集,嚴(yán)重威脅生態(tài)系統(tǒng)和人體健康[1-3]。2014年《全國土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示,我國耕地土壤中多環(huán)芳烴污染點(diǎn)位超標(biāo)率高達(dá)1.4%,重度污染占到了0.2%[4]。在南京工業(yè)污染場地表層土壤中的PAHs平均濃度達(dá)到了17.64 mg·kg-1[5]。PAHs污染形勢(shì)嚴(yán)峻,因此如何利用有效手段規(guī)避環(huán)境和污染區(qū)作物PAHs污染風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)是目前的研究重點(diǎn)。

        植物-微生物聯(lián)合修復(fù)汲取了植物和微生物修復(fù)的優(yōu)勢(shì),近來受到廣泛關(guān)注[6-8]。植物中存在數(shù)量龐大、種類豐富多樣的內(nèi)生細(xì)菌,植物與內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生細(xì)菌之間的互利共生關(guān)系保證了內(nèi)生細(xì)菌能夠長期穩(wěn)定的定殖在植物體內(nèi)[9]。植物為內(nèi)生菌提供場所、營養(yǎng)和防護(hù)[8],內(nèi)生菌相比根際細(xì)菌具有更強(qiáng)抵御生物和非生物脅迫的能力[10]。Siciliano等[11]研究表明,在污染地區(qū)的具有難降解物降解能力的細(xì)菌中內(nèi)生細(xì)菌占比高于根際細(xì)菌,暗示在這些難降解物的代謝中內(nèi)生細(xì)菌發(fā)揮主要作用。另外,一些內(nèi)生細(xì)菌可以通過自身分泌乙烯和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸鹽(ACC)脫氨酶等物質(zhì)促進(jìn)植物生長[12],代謝有機(jī)污染物,增強(qiáng)植物抗逆性,提高產(chǎn)量[13]。研究表明一些植物內(nèi)生細(xì)菌具有降解植物體內(nèi)有機(jī)污染物的能力,常見降解菌有 Pantoea 屬[14]、Pseudomona 屬[15]、Sphingo?bacterium屬[16]等。黑麥草、紫花苜蓿等牧草常作為修復(fù)植物,其吸收積累的PAHs會(huì)隨食物鏈進(jìn)入牲畜和野生動(dòng)物體內(nèi),危害食品和生態(tài)安全,因此如何在高效修復(fù)的同時(shí)降低植物體內(nèi)PAHs污染是亟待解決的問題。將功能菌定殖到植物體內(nèi),有助于降低植物污染風(fēng)險(xiǎn),提高修復(fù)效果。Sun等[17]將從看麥娘中分離篩選出的芘降解內(nèi)生細(xì)菌Staphylococcus sp.BJO6定殖到黑麥草體內(nèi)能夠促進(jìn)植株生長并有效降低植株芘積累量。由此可見,利用功能內(nèi)生菌定殖植物是規(guī)避植物PAHs等有機(jī)物污染的有效途徑。內(nèi)生菌群在植物代謝體內(nèi)PAHs等有機(jī)污染物的過程中起重要作用。菌群組成和結(jié)構(gòu)影響其對(duì)有機(jī)污染物的降解能力。Vila等[18]研究海洋重油降解菌群的菌群結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn),在能夠高效降解3~5環(huán)PAHs的海洋細(xì)菌群落中,Alphaproteobacteria細(xì)菌與低環(huán)PAHs的降解相關(guān),而Gammaproteobacteria細(xì)菌則與高環(huán)PAHs的降解相關(guān)。彭安萍等[19]提出可以利用植物中功能內(nèi)生細(xì)菌調(diào)控PAHs的吸收和代謝,這對(duì)于保障污染區(qū)作物安全和修復(fù)污染區(qū)土壤具有重要意義。研究功能菌定殖對(duì)PAHs污染植物體內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌種群的影響,有助于了解功能菌與內(nèi)生細(xì)菌和植物的作用關(guān)系,篩選出更多具有高效降解能力的功能內(nèi)生細(xì)菌。

        芘為四環(huán)多環(huán)芳烴的典型代表,常用作PAHs污染測定的指示物和生物降解研究的模型分子[20]。黑麥草是一種常見的牧草,具有生長迅速、根系發(fā)達(dá)的特點(diǎn),能耐受高濃度的PAHs污染,常用于有機(jī)污染的植物修復(fù)[21]。本研究以芘作污染物,黑麥草為供試植物,采用水培體系研究了芘降解功能內(nèi)生細(xì)菌Ser?ratia sp.PW7定殖(浸根和浸種)對(duì)黑麥草體內(nèi)芘污染去除以及可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的影響,并進(jìn)一步探究功能內(nèi)生細(xì)菌定殖對(duì)有機(jī)污染物代謝的影響機(jī)制,為功能內(nèi)生菌-植物體系修復(fù)PAHs污染提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        1.1.1 功能菌株、宿主植物及芘

        供試菌株為本實(shí)驗(yàn)室分離的一株植物功能內(nèi)生細(xì)菌PW7(Serratia sp.),16S rRNA基因在GenBank登錄號(hào)為MG922497,具有高效芘降解能力,對(duì)鏈霉素、壯觀霉素及四環(huán)素具有良好抗性[22]。

        供試植物為黑麥草(Lolium multiflorum L.),購自明達(dá)種子公司。

        本研究所用芘,分子式為C16H10,純度大于98%,純水中溶解度為0.12 mg·L-1,辛醇-水分配系數(shù)(lg Kow)為5.18,購自德國Fluka公司。

        1.1.2 培養(yǎng)基

        植物水培體系采用Hoagland營養(yǎng)液[23],植物中總可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基[23],功能內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)采用含芘及兩種抗生素的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基[24]。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 功能菌株定殖及水培實(shí)驗(yàn)

        本實(shí)驗(yàn)設(shè)置浸根定殖(LR)、浸種定殖(LS)和未接菌對(duì)照組(LK),各接種處理黑麥草分別暴露于含0、0.1、0.5 mg·L-1芘的Hoagland培養(yǎng)液中。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置9組處理,每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

        接種菌株P(guān)W7菌懸液制備:單菌落接種LB液體培養(yǎng)基中,30 ℃ 150 r·min-1搖床培養(yǎng) 24 h,8000 r·min-1離心5 min收集菌體,用液體基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基清洗2遍后調(diào)整菌懸液OD600nm值至1.0,4℃?zhèn)溆谩:邴湶萁臃N方法如下:(1)浸根定殖:黑麥草種子經(jīng)過表面消毒,催苗育種48 h后,在Hoagland培養(yǎng)液中培養(yǎng)至株高約10 cm左右,菌懸液浸泡黑麥草根部6 h,無菌水沖洗后備用。(2)浸種定殖:經(jīng)過表面消毒的黑麥草種子,催苗育種48 h后,菌懸液浸泡6 h,無菌水沖洗后,在Hoagland培養(yǎng)液中培養(yǎng)至株高約10 cm左右備用。接種處理后的幼苗移苗至裝有250 mL不同芘濃度Hoagland培養(yǎng)液的棕色廣口瓶中,每瓶10株,置于晝夜溫度25℃/20℃的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)4 d后采集植物樣品進(jìn)行芘含量和內(nèi)生菌群測定。

        1.2.2 植物體內(nèi)定殖菌和內(nèi)生細(xì)菌計(jì)數(shù)及分離純化

        采用菌落計(jì)數(shù)的方法表征功能菌在植物體內(nèi)的定殖效率:清洗后的新鮮植物莖葉和根部依次經(jīng)過75%的乙醇浸泡3 min、無菌水沖洗3~4次、2%的次氯酸鈉溶液漂洗3 min,無菌水沖洗5次后置于固體LB平板上,30℃恒溫培養(yǎng)48 h,若無菌落產(chǎn)生,表明表面滅菌成功。經(jīng)表面滅菌處理的植物樣品,研磨成勻漿后進(jìn)行梯度稀釋,涂布于基礎(chǔ)鹽抗性平板(芘終濃度 50 mg·L-1、鏈霉素終濃度 100 mg·L-1、壯觀霉素終濃度100 mg·L-1),30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h,設(shè)3個(gè)重復(fù),結(jié)合菌落形態(tài)觀察和16S rRNA基因測序驗(yàn)證進(jìn)行平板計(jì)數(shù),計(jì)算出每克鮮組織含菌量(lg CFU·g-1)

        可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌計(jì)數(shù)及分離純化:植物樣品經(jīng)表面滅菌處理后研磨成勻漿并進(jìn)行梯度稀釋,涂布于LB固體平板,30℃恒溫培養(yǎng)72 h,每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。長出菌落后,對(duì)各菌落進(jìn)行菌落形態(tài)觀察并計(jì)數(shù),找出優(yōu)勢(shì)菌落。然后采用劃線分離方法,對(duì)不同菌落進(jìn)行進(jìn)一步分離、純化。最后將純化的菌落劃線于LB固體平板上,培養(yǎng)后于4℃短期保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.3 植物內(nèi)生細(xì)菌鑒定及對(duì)芘的降解能力驗(yàn)證

        利用菌落形態(tài)觀察和16S rRNA基因序列同源性分析鑒定分離得到的植物內(nèi)生細(xì)菌菌株,并確定其分類地位。提取各內(nèi)生細(xì)菌總DNA(細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒,TIANGEN)為模板進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增。采用引物為27f(5′-AGAGTTTGATCATG?GCTCAG-3′)和 1492r(5′-GGTTACCTTGTTAC?GACTT-3′)。PCR擴(kuò)增體系:正反向引物各0.5 μL、Premix Taq(TaKaRa)12.5 μL、模板DNA 1 μL,無菌水定容至25 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,32個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送金斯瑞生物科技有限公司測序。在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中將測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行16S rRNA基因序列同源性比對(duì)分析,同時(shí)提交各內(nèi)生細(xì)菌測序序列至GenBank并獲得登錄號(hào)。各可培養(yǎng)內(nèi)生菌按5%接種量測試其在以芘為唯一碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中15 d對(duì)20 mg·L-1芘的降解能力。

        1.2.4 植物內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析

        植物可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性分析采用Shan?non-Wiener多樣性指數(shù)(H)和均勻性指數(shù)(J),其計(jì)算公式如下:

        H=∑piln pi

        J=H/ln S

        式中:pi為某處理組中各內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量占比;S為某處理組內(nèi)生細(xì)菌群落所有種屬數(shù)。

        1.2.5 芘測定

        植物樣品芘提取方法參照文獻(xiàn)[25]。具體操作:植物根和莖葉冷凍干燥后,稱量干質(zhì)量(生物量);經(jīng)研磨粉粹均勻后稱取一定量植物樣品于玻璃離心管中,每次10 mL加入二氯甲烷和正己烷等體積混合溶液超聲萃取30 min,重復(fù)3次;萃取液經(jīng)無水硫酸鈉柱-硅膠柱凈化,用10 mL二氯甲烷和正己烷等體積混合液洗脫后收集至圓底燒瓶;40℃恒溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,甲醇定容至5 mL,過0.22 μm孔徑濾膜后,采用高效液相色譜(HPLC)定量分析。培養(yǎng)液中芘提?。喝?0 mL Hoagland培養(yǎng)液于玻璃離心管中,加等體積甲醇,超聲萃取30 min,過0.22 μm孔徑濾膜后,HPLC定量分析。HPLC分析參數(shù):烷基C18反相色譜柱(4.6 mm×150 mm),流動(dòng)相甲醇∶水(V∶V)=90∶10,流速1.000 mL·min-1,柱溫40 ℃,進(jìn)樣量20 μL。

        1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

        采用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制,SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素(ANOVA)方差分析和雙因素相關(guān)性分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 植物生物量及樣品中芘含量

        菌株P(guān)W7定殖促進(jìn)了黑麥草幼苗的生長,提高了植株生物量(表1)。在高濃度污染情況下,定殖對(duì)植株的促生作用更顯著。定殖的促生作用在莖葉的生長上更加明顯,定殖后莖葉生物量增加7.7%~28.0%,根生物量增加5.3%~27.6%。比較2種定殖方法,浸根定殖的促進(jìn)作用大于浸種。與對(duì)照相比,浸根處理后低濃度 0.1 mg·L-1和高濃度 0.5 mg·L-1芘污染組植株根生物量顯著提高了18.5%和27.6%。本研究表明菌株P(guān)W7定殖能夠顯著降低黑麥草體內(nèi)和水培液中的芘污染。在高濃度芘污染水平下,相比未接菌對(duì)照組,浸根接種和浸種接種使植株根中芘濃度顯著降低了44.2%和19.9%,使植株莖葉中芘濃度顯著降低了42.3%和22.2%。浸根接種更高效地去除了植物體內(nèi)的芘。此外,相比未接菌對(duì)照,在低濃度芘污染組,培養(yǎng)液中芘去除率經(jīng)浸種和浸根定殖后分別顯著提高了29個(gè)和38個(gè)百分點(diǎn),在高濃度芘污染組,浸根定殖后培養(yǎng)液中芘去除率顯著提高了18個(gè)百分點(diǎn)。這些結(jié)果表明,功能菌株P(guān)W7定殖能夠有效去除植物體內(nèi)和環(huán)境中的芘污染,其中浸根與浸種定殖雖效果不同,但均為有效的修復(fù)方法。

        2.2 植物體內(nèi)定殖的PW7數(shù)量

        菌株P(guān)W7在黑麥草體內(nèi)的數(shù)量代表了其在黑麥草體內(nèi)的定殖效率。圖1表明,黑麥草莖葉和根中定殖菌數(shù)量為3.49~7.63 lg CFU·g-1,表明大量的菌株P(guān)W7能夠成功定殖在植株體內(nèi)生存繁殖。相同處理組,植株根中定殖菌數(shù)量均為莖葉中的100倍以上,表明菌株主要定殖在根中,但可以移動(dòng)到莖葉部。同一芘污染水平下,浸根組根和莖葉中的定殖菌數(shù)量均比浸種組大一個(gè)數(shù)量級(jí),表明與浸種定殖相比浸根定殖菌株P(guān)W7在植株體內(nèi)的定殖效率更高、效果更好。此外,隨著芘濃度的提高,植株根和莖葉中定殖菌數(shù)量均有增加的趨勢(shì),其中浸種組植物莖葉中的定殖菌數(shù)量變化顯著,表明一定濃度芘污染有利于菌株P(guān)W7的生存繁殖。

        圖1 黑麥草根和莖葉中菌株P(guān)W7定殖數(shù)量Figure 1 Cell counts of strain PW7 in the roots and shoots of inoculated ryegrass

        表1 菌株P(guān)W7定殖對(duì)黑麥草生長以及芘殘留的影響Table 1 Effects of inoculation with strain PW7 on the plant growth,pyrene removal in the plant and Hoagland solutions

        2.3 植物可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量

        芘污染和功能菌株定殖能夠影響黑麥草根和莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量。由圖2可知,未接菌組中,與無芘污染相比,芘污染使植株根中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量顯著下降,而莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量顯著提高,但高濃度芘處理植株莖葉中內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量相比低濃度芘處理顯著下降。在相同芘污染水平下,菌株P(guān)W7定殖改變了植株中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量。其中無污染和低濃度芘污染水平下,功能菌定殖降低了根中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量,提高了莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量;高濃度芘污染水平下,定殖使植株根和莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量均有所提高。與未接菌對(duì)照組相比,浸根對(duì)黑麥草根和莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量的影響更顯著,這可能是菌株P(guān)W7定殖提高植物體內(nèi)和環(huán)境中芘去除率的原因。

        2.4 植物內(nèi)生細(xì)菌分離、鑒定及分類分析

        圖2 不同芘污染及定殖處理對(duì)黑麥草中總內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量的影響Figure 2 Effects of pyrene contamination and strain PW7 inoculation on the cell counts of cultivable endophytic bacteria in ryegrass

        圖3 LB培養(yǎng)基上32株內(nèi)生細(xì)菌照片F(xiàn)igure 3 Photographs of colonies of the 32 endophytic bacterial strains on LB medium plate

        表2 不同處理組黑麥草中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌分類匯總Table 2 Cultivable endophytic bacterial strains isolated from the ryegrass

        本研究從不同芘污染和定殖處理組的黑麥草植株體內(nèi)共分離出32株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌,各內(nèi)生細(xì)菌菌落形態(tài)如圖3所示,表明植物內(nèi)生細(xì)菌具有豐富的多樣性。從表2可以看出,根據(jù)16S rRNA基因序列同源性比對(duì)分析,黑麥草體內(nèi)的32株內(nèi)生細(xì)菌分別屬于 Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Beta?proteobacteria、Actinobacteria、Bacilli和Flavobacteria 6個(gè)綱,其中Gammaproteobacteria和Actinobacteria為根中優(yōu)勢(shì)綱,而Actinobacteria和Flavobacteria為莖葉中優(yōu)勢(shì)綱。從屬分類水平上看,這32株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌分屬21個(gè)屬,其中Microbacterium屬的細(xì)菌種類最多,Pseudomonas屬、Paenibacillus屬次之。32株內(nèi)生細(xì)菌中,6株根部特有(PYRL9、PYRL10、PYRL12、PYRL19、PYRL23、PYRL25)、3 株 莖 葉 部 特 有(PYRL2、PYRL29、PYRL32)、4株芘污染植株特有(PYRL9、PYRL10、PYRL12、PYRL13)、4株接菌植株特有(PYRL9、PYRL22、PYRL23、PYRL25)。此外,在芘污染條件下,菌株P(guān)W7定殖黑麥草增加了黑麥草體內(nèi)的可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的種類,菌株P(guān)W7浸根接種的黑麥草根部內(nèi)生細(xì)菌種數(shù)最多,低濃度和高濃度芘污染水平下分別為17種和16種。

        2.5 植物可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌種群特性

        采用香農(nóng)-威爾指數(shù)(H)和均勻性指數(shù)(J)兩個(gè)生物多樣性指數(shù)來表征黑麥草根和莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的種群多樣性。如表3所示,未接菌組中,與無污染相比,除低濃度芘處理組根中內(nèi)生細(xì)菌種群的香農(nóng)-威爾指數(shù)和均勻性指數(shù)升高外,其他組均有所降低,表明除低濃度芘污染能略微提高黑麥草內(nèi)生細(xì)菌種群多樣性和均勻度外,芘污染會(huì)降低可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌種群的多樣性和均勻度,污染水平越高,影響越明顯。在相同濃度芘污染條件下,菌株P(guān)W7浸根和浸種定殖均能夠提高芘污染黑麥草根和莖中內(nèi)生細(xì)菌種群的香農(nóng)-威爾指數(shù),只是提高程度存在差異,均勻性指數(shù)與香農(nóng)-威爾指數(shù)存在類似規(guī)律。表明功能菌定殖能夠提高黑麥草內(nèi)生細(xì)菌種群多樣性和均勻度,降低芘污染對(duì)黑麥草內(nèi)生細(xì)菌種群多樣性的影響。

        表3 黑麥草根和莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌種群分析Table 3 Populations of endophytic bacteria in ryegrass seedlings

        芘污染和菌株P(guān)W7定殖還會(huì)影響黑麥草根和莖葉可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)種屬,影響內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。從表3可知,未接菌組中,芘污染黑麥草根中優(yōu)勢(shì)種屬由Micrococcus屬和Rhizobium屬變?yōu)镻an?toea屬,芘污染黑麥草莖葉中絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種屬由Curto?bacterium屬變?yōu)镸icrobacterium屬。相同芘污染水平下,菌株P(guān)W7接種后,黑麥草根部Serratia屬成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種屬(LR0.5中為略優(yōu)勢(shì)種屬),黑麥草莖葉部優(yōu)勢(shì)種屬中的Chryseobacterium屬變?yōu)镻antoea屬(LS0.1、LR0.1)、Pseudomona屬(LS0.5)和Sphingobacte?rium屬(LR0.5)。

        對(duì)比表3中不同處理組黑麥草根和莖葉部優(yōu)勢(shì)菌株的芘降解效能發(fā)現(xiàn),黑麥草內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌株均對(duì)芘具有一定的降解能力,其中菌株P(guān)YRL3(Erwinia)、PYRL11(Serratia)、PYRL14(Rhizobium)、PYRL15(Sphin?gobacterium)、PYRL18(Curtobacterium)、PYRL19(Kocu?ria)、PYRL24(Micrococcus)對(duì)20 mg·L-1芘的15 d降解率超過55%。在芘污染條件下,定殖黑麥草內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌株芘降解能力普遍高于未接菌黑麥草內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌株,表明菌株P(guān)W7定殖能夠通過改變黑麥草內(nèi)群落組成提高植物中芘去除能力。此外,各處理組根部優(yōu)勢(shì)菌株芘降解能力普遍高于莖葉中優(yōu)勢(shì)菌,表明根是黑麥草生物降解芘的主要部位。

        3 討論

        功能內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)的定殖效率是其發(fā)揮生物防治作用的關(guān)鍵因素[26]。本研究中接菌處理后定殖在黑麥草根和莖葉部的定殖菌株P(guān)W7數(shù)量達(dá)103~107CFU·g-1,表明菌株P(guān)W7能夠成功定殖在黑麥草組織中并能良好生存和繁殖。菌株P(guān)W7的高效定殖有利于降低植物芘污染和促進(jìn)植物生長。相關(guān)性分析表明:在芘污染條件下,黑麥草體內(nèi)功能菌定殖數(shù)量與植株生長增量顯著正相關(guān)(根中ρ=0.647,P=0.031;莖葉中ρ=0.661,P=0.038);特別是芘污染下黑麥草體內(nèi)功能菌定殖數(shù)量與植株中芘污染去除也顯著正相關(guān)(根中ρ=0.879,P=0.01;莖葉中ρ=0.655,P=0.029)。研究表明,內(nèi)生細(xì)菌的定殖效率受很多因素影響,除植物自身因素[27]、內(nèi)生細(xì)菌基因組[28]等因素外,定殖方式也會(huì)影響功能內(nèi)生細(xì)菌的定殖效率。Afzal等[6]采用4種定殖方式將內(nèi)生細(xì)菌Burkholderia phytofirmans PsJN接種到柴油污染地區(qū)的黑麥草體內(nèi),結(jié)果表明,PsJN菌株灌根接種的定殖效率最高,表現(xiàn)出最佳的生防效果。本研究結(jié)果也證實(shí)相比浸種接種,浸根接種黑麥草的菌株P(guān)W7定殖效率更高,降低芘污染風(fēng)險(xiǎn)的效果更好。

        隨著芘污染濃度的增大,黑麥草根中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量顯著減少,莖葉中的數(shù)量在低濃度增加,在高濃度減少,且變化顯著。Liu等[29]的研究結(jié)果也表明隨著菲污染濃度的升高,小麥根中內(nèi)生細(xì)菌總數(shù)減少,莖葉中先增后減。說明低濃度PAHs污染能促進(jìn)植物莖葉中內(nèi)生細(xì)菌生長,高濃度表現(xiàn)出抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)W7定殖提高了高濃度芘污染下黑麥草根和莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量,而且可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量與功能菌定殖效率有關(guān),相關(guān)性分析表明根中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量與功能菌定殖效率呈正相關(guān)關(guān)系(ρ=0.681,P=0.015),且根中內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量增加與植物體內(nèi)芘污染去除顯著正相關(guān)(ρ=0.668,P=0.035)。這些結(jié)果說明,菌株P(guān)W7也可通過提高植物體內(nèi)總可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量降低植物體內(nèi)芘污染。

        本研究分別從黑麥草體內(nèi)分離出21屬共32株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌,分別屬于Gammaproteobacteria、Alpha?proteobacteria、Betaproteobacteria、Actinobacteria、Ba?cilli和Flavobacteria 6個(gè)綱,表現(xiàn)出植物內(nèi)生菌群豐富的多樣性。豐富多樣的內(nèi)生細(xì)菌有利于促進(jìn)植物生長、提高抗逆性。高濃度PAHs污染能夠降低微生物多樣性,Wang等[30]研究表明在高濃度PAHs污染下沉積物中細(xì)菌多樣性顯著下降,而Cravo-Laureau等[31]認(rèn)為菌群多樣性降低會(huì)嚴(yán)重影響污染物的降解。通過多樣性指數(shù)分析發(fā)現(xiàn),高濃度芘污染能夠降低植物內(nèi)生細(xì)菌的多樣性和均勻度,但菌株P(guān)W7浸根和浸種定殖均能有效提高黑麥草根和莖葉中內(nèi)生細(xì)菌的多樣性和均勻度,緩解了芘污染對(duì)植物內(nèi)生細(xì)菌多樣性的破壞作用。這結(jié)果與Afzal等[6]的研究一致,表明利用植物與內(nèi)生細(xì)菌聯(lián)合作用是修復(fù)有機(jī)物污染的有效方法。

        盛月慧等[23]將5種濃度菲作用于黑麥草后發(fā)現(xiàn),根、莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌種群發(fā)生了不同程度的改變,植物內(nèi)生細(xì)菌能對(duì)有機(jī)物污染做出響應(yīng)。而菌株P(guān)W7定殖能使芘污染黑麥草根和莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌群落組成產(chǎn)生明顯變化,改變植物優(yōu)勢(shì)種屬,增強(qiáng)對(duì)有機(jī)污染物的代謝能力。芘降解菌株P(guān)W7定殖后其所屬的Serratia屬成為黑麥草根中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)屬,其他優(yōu)勢(shì)屬Pantoea屬、Micrococcus屬和Erwinia屬也表現(xiàn)出較高的芘降解潛能。宋立超等[14]用菌株P(guān)antoea sp.TJB5胞內(nèi)酶對(duì)50 mg·L-1菲處理12 h的降解率達(dá)到70.1%。Nida等[32]將Micrococcus屬細(xì)菌制成菌蠟球用于石油烴降解。定殖處理后芘污染黑麥草莖葉中的優(yōu)勢(shì)屬M(fèi)icrobacterium屬[33]、Pantoea屬、Pseudomona屬[15]和Sphingobacterium屬[16]也均被報(bào)道過具有芳香烴降解潛能。Phillips等[15]研究紫花苜蓿內(nèi)生細(xì)菌群落與芳香烴污染降解能力的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn),當(dāng)Pseudomonas屬存在時(shí),植物烷烴代謝能力提高,而當(dāng)Pseudomonas屬和Brevundimonas屬共同存在時(shí),植物芳香烴的代謝能力提高。功能菌定殖后這些具有芘降解潛能的屬成為植物中的優(yōu)勢(shì)屬,提高了植物代謝芘的能力,降低了植物和環(huán)境中芘的污染風(fēng)險(xiǎn)。此外,浸根和浸種處理黑麥草內(nèi)生細(xì)菌群落組成的差異可能是兩種定殖方式的定殖效率不同造成的。

        綜上所述,明確功能內(nèi)生細(xì)菌定殖對(duì)植物生長量、體內(nèi)芘含量及內(nèi)生細(xì)菌群落的影響,有助于利用內(nèi)生細(xì)菌調(diào)控植物對(duì)PAHs的吸收和代謝,篩選更多具有高效降解潛能的內(nèi)生細(xì)菌,完善有機(jī)污染物的植物-微生物聯(lián)合修復(fù)方法,進(jìn)而有效規(guī)避有機(jī)物污染區(qū)作物的污染風(fēng)險(xiǎn)。然而,功能內(nèi)生細(xì)菌定殖對(duì)植物內(nèi)生細(xì)菌種群的影響機(jī)制和定殖方式的影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

        4 結(jié)論

        (1)芘降解內(nèi)生細(xì)菌PW7能高效定殖在黑麥草根和莖葉中,促進(jìn)植物生長,提高芘污染黑麥草根和莖葉中內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量和多樣性,改變黑麥草內(nèi)生細(xì)菌群落組成,進(jìn)一步提高了植物中芘的代謝能力,顯著降低了植物芘污染。

        (2)浸根與浸種兩種定殖方式均為有效可行的定殖修復(fù)方式,相比浸種定殖,具有更高定殖效率的浸根定殖表現(xiàn)出更顯著的促生作用、菌群改變和減芘效果。關(guān)于定殖方式對(duì)內(nèi)生菌群及芘污染去除的影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

        (3)功能菌浸根和浸種定殖是高效的有機(jī)物環(huán)境污染植物-微生物聯(lián)合修復(fù)方法,能有效規(guī)避污染區(qū)作物污染風(fēng)險(xiǎn),為更多功能菌株的發(fā)現(xiàn)和微生物菌種在污染修復(fù)中的應(yīng)用提供依據(jù)和參考。

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