李 爽，左尚武，王萬清，王金嵩，權(quán)成偉，朱雪竹*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京 210095；2.北京科技大學(xué)天津?qū)W院，天津 301830）

多環(huán)芳烴（PAHs）是一類環(huán)境中廣泛存在的持久性有機(jī)污染物，具有致癌性、致畸性和致突變性，因其具有強(qiáng)疏水性和較高的辛醇-水分配系數(shù)，易于被植物吸收積累并通過食物鏈富集，嚴(yán)重威脅生態(tài)系統(tǒng)和人體健康[1-3]。2014年《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示，我國(guó)耕地土壤中多環(huán)芳烴污染點(diǎn)位超標(biāo)率高達(dá)1.4%，重度污染占到了0.2%[4]。在南京工業(yè)污染場(chǎng)地表層土壤中的PAHs平均濃度達(dá)到了17.64 mg·kg-1[5]。PAHs污染形勢(shì)嚴(yán)峻，因此如何利用有效手段規(guī)避環(huán)境和污染區(qū)作物PAHs污染風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)是目前的研究重點(diǎn)。

植物-微生物聯(lián)合修復(fù)汲取了植物和微生物修復(fù)的優(yōu)勢(shì)，近來受到廣泛關(guān)注[6-8]。植物中存在數(shù)量龐大、種類豐富多樣的內(nèi)生細(xì)菌，植物與內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生細(xì)菌之間的互利共生關(guān)系保證了內(nèi)生細(xì)菌能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定的定殖在植物體內(nèi)[9]。植物為內(nèi)生菌提供場(chǎng)所、營(yíng)養(yǎng)和防護(hù)[8]，內(nèi)生菌相比根際細(xì)菌具有更強(qiáng)抵御生物和非生物脅迫的能力[10]。Siciliano等[11]研究表明，在污染地區(qū)的具有難降解物降解能力的細(xì)菌中內(nèi)生細(xì)菌占比高于根際細(xì)菌，暗示在這些難降解物的代謝中內(nèi)生細(xì)菌發(fā)揮主要作用。另外，一些內(nèi)生細(xì)菌可以通過自身分泌乙烯和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸鹽（ACC）脫氨酶等物質(zhì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)[12]，代謝有機(jī)污染物，增強(qiáng)植物抗逆性，提高產(chǎn)量[13]。研究表明一些植物內(nèi)生細(xì)菌具有降解植物體內(nèi)有機(jī)污染物的能力，常見降解菌有 Pantoea 屬[14]、Pseudomona 屬[15]、Sphingo?bacterium屬[16]等。黑麥草、紫花苜蓿等牧草常作為修復(fù)植物，其吸收積累的PAHs會(huì)隨食物鏈進(jìn)入牲畜和野生動(dòng)物體內(nèi)，危害食品和生態(tài)安全，因此如何在高效修復(fù)的同時(shí)降低植物體內(nèi)PAHs污染是亟待解決的問題。將功能菌定殖到植物體內(nèi)，有助于降低植物污染風(fēng)險(xiǎn)，提高修復(fù)效果。Sun等[17]將從看麥娘中分離篩選出的芘降解內(nèi)生細(xì)菌Staphylococcus sp.BJO6定殖到黑麥草體內(nèi)能夠促進(jìn)植株生長(zhǎng)并有效降低植株芘積累量。由此可見，利用功能內(nèi)生菌定殖植物是規(guī)避植物PAHs等有機(jī)物污染的有效途徑。內(nèi)生菌群在植物代謝體內(nèi)PAHs等有機(jī)污染物的過程中起重要作用。菌群組成和結(jié)構(gòu)影響其對(duì)有機(jī)污染物的降解能力。Vila等[18]研究海洋重油降解菌群的菌群結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在能夠高效降解3～5環(huán)PAHs的海洋細(xì)菌群落中，Alphaproteobacteria細(xì)菌與低環(huán)PAHs的降解相關(guān)，而Gammaproteobacteria細(xì)菌則與高環(huán)PAHs的降解相關(guān)。彭安萍等[19]提出可以利用植物中功能內(nèi)生細(xì)菌調(diào)控PAHs的吸收和代謝，這對(duì)于保障污染區(qū)作物安全和修復(fù)污染區(qū)土壤具有重要意義。研究功能菌定殖對(duì)PAHs污染植物體內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌種群的影響，有助于了解功能菌與內(nèi)生細(xì)菌和植物的作用關(guān)系，篩選出更多具有高效降解能力的功能內(nèi)生細(xì)菌。

芘為四環(huán)多環(huán)芳烴的典型代表，常用作PAHs污染測(cè)定的指示物和生物降解研究的模型分子[20]。黑麥草是一種常見的牧草，具有生長(zhǎng)迅速、根系發(fā)達(dá)的特點(diǎn)，能耐受高濃度的PAHs污染，常用于有機(jī)污染的植物修復(fù)[21]。本研究以芘作污染物，黑麥草為供試植物，采用水培體系研究了芘降解功能內(nèi)生細(xì)菌Ser?ratia sp.PW7定殖（浸根和浸種）對(duì)黑麥草體內(nèi)芘污染去除以及可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的影響，并進(jìn)一步探究功能內(nèi)生細(xì)菌定殖對(duì)有機(jī)污染物代謝的影響機(jī)制，為功能內(nèi)生菌-植物體系修復(fù)PAHs污染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 功能菌株、宿主植物及芘

供試菌株為本實(shí)驗(yàn)室分離的一株植物功能內(nèi)生細(xì)菌PW7（Serratia sp.），16S rRNA基因在GenBank登錄號(hào)為MG922497，具有高效芘降解能力，對(duì)鏈霉素、壯觀霉素及四環(huán)素具有良好抗性[22]。

供試植物為黑麥草（Lolium multiflorum L.），購(gòu)自明達(dá)種子公司。

本研究所用芘，分子式為C16H10，純度大于98%，純水中溶解度為0.12 mg·L-1，辛醇-水分配系數(shù)（lg Kow）為5.18，購(gòu)自德國(guó)Fluka公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

植物水培體系采用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液[23]，植物中總可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基[23]，功能內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)采用含芘及兩種抗生素的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基[24]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 功能菌株定殖及水培實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置浸根定殖（LR）、浸種定殖（LS）和未接菌對(duì)照組（LK），各接種處理黑麥草分別暴露于含0、0.1、0.5 mg·L-1芘的Hoagland培養(yǎng)液中。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置9組處理，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

接種菌株P(guān)W7菌懸液制備：?jiǎn)尉浣臃NLB液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 150 r·min-1搖床培養(yǎng) 24 h，8000 r·min-1離心5 min收集菌體，用液體基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基清洗2遍后調(diào)整菌懸液OD600nm值至1.0，4℃?zhèn)溆?。黑麥草接種方法如下：（1）浸根定殖：黑麥草種子經(jīng)過表面消毒，催苗育種48 h后，在Hoagland培養(yǎng)液中培養(yǎng)至株高約10 cm左右，菌懸液浸泡黑麥草根部6 h，無菌水沖洗后備用。（2）浸種定殖：經(jīng)過表面消毒的黑麥草種子，催苗育種48 h后，菌懸液浸泡6 h，無菌水沖洗后，在Hoagland培養(yǎng)液中培養(yǎng)至株高約10 cm左右備用。接種處理后的幼苗移苗至裝有250 mL不同芘濃度Hoagland培養(yǎng)液的棕色廣口瓶中，每瓶10株，置于晝夜溫度25℃/20℃的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)4 d后采集植物樣品進(jìn)行芘含量和內(nèi)生菌群測(cè)定。

1.2.2 植物體內(nèi)定殖菌和內(nèi)生細(xì)菌計(jì)數(shù)及分離純化

采用菌落計(jì)數(shù)的方法表征功能菌在植物體內(nèi)的定殖效率：清洗后的新鮮植物莖葉和根部依次經(jīng)過75%的乙醇浸泡3 min、無菌水沖洗3～4次、2%的次氯酸鈉溶液漂洗3 min，無菌水沖洗5次后置于固體LB平板上，30℃恒溫培養(yǎng)48 h，若無菌落產(chǎn)生，表明表面滅菌成功。經(jīng)表面滅菌處理的植物樣品，研磨成勻漿后進(jìn)行梯度稀釋，涂布于基礎(chǔ)鹽抗性平板（芘終濃度 50 mg·L-1、鏈霉素終濃度 100 mg·L-1、壯觀霉素終濃度100 mg·L-1），30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，設(shè)3個(gè)重復(fù)，結(jié)合菌落形態(tài)觀察和16S rRNA基因測(cè)序驗(yàn)證進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，計(jì)算出每克鮮組織含菌量（lg CFU·g-1）

可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌計(jì)數(shù)及分離純化：植物樣品經(jīng)表面滅菌處理后研磨成勻漿并進(jìn)行梯度稀釋，涂布于LB固體平板，30℃恒溫培養(yǎng)72 h，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。長(zhǎng)出菌落后，對(duì)各菌落進(jìn)行菌落形態(tài)觀察并計(jì)數(shù)，找出優(yōu)勢(shì)菌落。然后采用劃線分離方法，對(duì)不同菌落進(jìn)行進(jìn)一步分離、純化。最后將純化的菌落劃線于LB固體平板上，培養(yǎng)后于4℃短期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 植物內(nèi)生細(xì)菌鑒定及對(duì)芘的降解能力驗(yàn)證

利用菌落形態(tài)觀察和16S rRNA基因序列同源性分析鑒定分離得到的植物內(nèi)生細(xì)菌菌株，并確定其分類地位。提取各內(nèi)生細(xì)菌總DNA（細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，TIANGEN）為模板進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增。采用引物為27f（5′-AGAGTTTGATCATG?GCTCAG-3′）和 1492r（5′-GGTTACCTTGTTAC?GACTT-3′）。PCR擴(kuò)增體系：正反向引物各0.5 μL、Premix Taq（TaKaRa）12.5 μL、模板DNA 1 μL，無菌水定容至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。在NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中將測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行16S rRNA基因序列同源性比對(duì)分析，同時(shí)提交各內(nèi)生細(xì)菌測(cè)序序列至GenBank并獲得登錄號(hào)。各可培養(yǎng)內(nèi)生菌按5%接種量測(cè)試其在以芘為唯一碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中15 d對(duì)20 mg·L-1芘的降解能力。

1.2.4 植物內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析

植物可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性分析采用Shan?non-Wiener多樣性指數(shù)（H）和均勻性指數(shù)（J），其計(jì)算公式如下：

H=∑piln pi

J=H/ln S

式中：pi為某處理組中各內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量占比；S為某處理組內(nèi)生細(xì)菌群落所有種屬數(shù)。

1.2.5 芘測(cè)定

植物樣品芘提取方法參照文獻(xiàn)[25]。具體操作：植物根和莖葉冷凍干燥后，稱量干質(zhì)量（生物量）；經(jīng)研磨粉粹均勻后稱取一定量植物樣品于玻璃離心管中，每次10 mL加入二氯甲烷和正己烷等體積混合溶液超聲萃取30 min，重復(fù)3次；萃取液經(jīng)無水硫酸鈉柱-硅膠柱凈化，用10 mL二氯甲烷和正己烷等體積混合液洗脫后收集至圓底燒瓶；40℃恒溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，甲醇定容至5 mL，過0.22 μm孔徑濾膜后，采用高效液相色譜（HPLC）定量分析。培養(yǎng)液中芘提取：取10 mL Hoagland培養(yǎng)液于玻璃離心管中，加等體積甲醇，超聲萃取30 min，過0.22 μm孔徑濾膜后，HPLC定量分析。HPLC分析參數(shù)：烷基C18反相色譜柱（4.6 mm×150 mm），流動(dòng)相甲醇∶水（V∶V）=90∶10，流速1.000 mL·min-1，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制，SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素（ANOVA）方差分析和雙因素相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生物量及樣品中芘含量

菌株P(guān)W7定殖促進(jìn)了黑麥草幼苗的生長(zhǎng)，提高了植株生物量（表1）。在高濃度污染情況下，定殖對(duì)植株的促生作用更顯著。定殖的促生作用在莖葉的生長(zhǎng)上更加明顯，定殖后莖葉生物量增加7.7%～28.0%，根生物量增加5.3%～27.6%。比較2種定殖方法，浸根定殖的促進(jìn)作用大于浸種。與對(duì)照相比，浸根處理后低濃度 0.1 mg·L-1和高濃度 0.5 mg·L-1芘污染組植株根生物量顯著提高了18.5%和27.6%。本研究表明菌株P(guān)W7定殖能夠顯著降低黑麥草體內(nèi)和水培液中的芘污染。在高濃度芘污染水平下，相比未接菌對(duì)照組，浸根接種和浸種接種使植株根中芘濃度顯著降低了44.2%和19.9%，使植株莖葉中芘濃度顯著降低了42.3%和22.2%。浸根接種更高效地去除了植物體內(nèi)的芘。此外，相比未接菌對(duì)照，在低濃度芘污染組，培養(yǎng)液中芘去除率經(jīng)浸種和浸根定殖后分別顯著提高了29個(gè)和38個(gè)百分點(diǎn)，在高濃度芘污染組，浸根定殖后培養(yǎng)液中芘去除率顯著提高了18個(gè)百分點(diǎn)。這些結(jié)果表明，功能菌株P(guān)W7定殖能夠有效去除植物體內(nèi)和環(huán)境中的芘污染，其中浸根與浸種定殖雖效果不同，但均為有效的修復(fù)方法。

2.2 植物體內(nèi)定殖的PW7數(shù)量

菌株P(guān)W7在黑麥草體內(nèi)的數(shù)量代表了其在黑麥草體內(nèi)的定殖效率。圖1表明，黑麥草莖葉和根中定殖菌數(shù)量為3.49～7.63 lg CFU·g-1，表明大量的菌株P(guān)W7能夠成功定殖在植株體內(nèi)生存繁殖。相同處理組，植株根中定殖菌數(shù)量均為莖葉中的100倍以上，表明菌株主要定殖在根中，但可以移動(dòng)到莖葉部。同一芘污染水平下，浸根組根和莖葉中的定殖菌數(shù)量均比浸種組大一個(gè)數(shù)量級(jí)，表明與浸種定殖相比浸根定殖菌株P(guān)W7在植株體內(nèi)的定殖效率更高、效果更好。此外，隨著芘濃度的提高，植株根和莖葉中定殖菌數(shù)量均有增加的趨勢(shì)，其中浸種組植物莖葉中的定殖菌數(shù)量變化顯著，表明一定濃度芘污染有利于菌株P(guān)W7的生存繁殖。

圖1 黑麥草根和莖葉中菌株P(guān)W7定殖數(shù)量Figure 1 Cell counts of strain PW7 in the roots and shoots of inoculated ryegrass

表1 菌株P(guān)W7定殖對(duì)黑麥草生長(zhǎng)以及芘殘留的影響Table 1 Effects of inoculation with strain PW7 on the plant growth，pyrene removal in the plant and Hoagland solutions

2.3 植物可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量

芘污染和功能菌株定殖能夠影響黑麥草根和莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量。由圖2可知，未接菌組中，與無芘污染相比，芘污染使植株根中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量顯著下降，而莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量顯著提高，但高濃度芘處理植株莖葉中內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量相比低濃度芘處理顯著下降。在相同芘污染水平下，菌株P(guān)W7定殖改變了植株中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量。其中無污染和低濃度芘污染水平下，功能菌定殖降低了根中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量，提高了莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量；高濃度芘污染水平下，定殖使植株根和莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量均有所提高。與未接菌對(duì)照組相比，浸根對(duì)黑麥草根和莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量的影響更顯著，這可能是菌株P(guān)W7定殖提高植物體內(nèi)和環(huán)境中芘去除率的原因。

2.4 植物內(nèi)生細(xì)菌分離、鑒定及分類分析

圖2 不同芘污染及定殖處理對(duì)黑麥草中總內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量的影響Figure 2 Effects of pyrene contamination and strain PW7 inoculation on the cell counts of cultivable endophytic bacteria in ryegrass

圖3 LB培養(yǎng)基上32株內(nèi)生細(xì)菌照片F(xiàn)igure 3 Photographs of colonies of the 32 endophytic bacterial strains on LB medium plate

表2 不同處理組黑麥草中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌分類匯總Table 2 Cultivable endophytic bacterial strains isolated from the ryegrass

本研究從不同芘污染和定殖處理組的黑麥草植株體內(nèi)共分離出32株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，各內(nèi)生細(xì)菌菌落形態(tài)如圖3所示，表明植物內(nèi)生細(xì)菌具有豐富的多樣性。從表2可以看出，根據(jù)16S rRNA基因序列同源性比對(duì)分析，黑麥草體內(nèi)的32株內(nèi)生細(xì)菌分別屬于 Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Beta?proteobacteria、Actinobacteria、Bacilli和Flavobacteria 6個(gè)綱，其中Gammaproteobacteria和Actinobacteria為根中優(yōu)勢(shì)綱，而Actinobacteria和Flavobacteria為莖葉中優(yōu)勢(shì)綱。從屬分類水平上看，這32株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌分屬21個(gè)屬，其中Microbacterium屬的細(xì)菌種類最多，Pseudomonas屬、Paenibacillus屬次之。32株內(nèi)生細(xì)菌中，6株根部特有（PYRL9、PYRL10、PYRL12、PYRL19、PYRL23、PYRL25）、3 株 莖 葉 部 特 有（PYRL2、PYRL29、PYRL32）、4株芘污染植株特有（PYRL9、PYRL10、PYRL12、PYRL13）、4株接菌植株特有（PYRL9、PYRL22、PYRL23、PYRL25）。此外，在芘污染條件下，菌株P(guān)W7定殖黑麥草增加了黑麥草體內(nèi)的可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的種類，菌株P(guān)W7浸根接種的黑麥草根部?jī)?nèi)生細(xì)菌種數(shù)最多，低濃度和高濃度芘污染水平下分別為17種和16種。

2.5 植物可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌種群特性

采用香農(nóng)-威爾指數(shù)（H）和均勻性指數(shù)（J）兩個(gè)生物多樣性指數(shù)來表征黑麥草根和莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的種群多樣性。如表3所示，未接菌組中，與無污染相比，除低濃度芘處理組根中內(nèi)生細(xì)菌種群的香農(nóng)-威爾指數(shù)和均勻性指數(shù)升高外，其他組均有所降低，表明除低濃度芘污染能略微提高黑麥草內(nèi)生細(xì)菌種群多樣性和均勻度外，芘污染會(huì)降低可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌種群的多樣性和均勻度，污染水平越高，影響越明顯。在相同濃度芘污染條件下，菌株P(guān)W7浸根和浸種定殖均能夠提高芘污染黑麥草根和莖中內(nèi)生細(xì)菌種群的香農(nóng)-威爾指數(shù)，只是提高程度存在差異，均勻性指數(shù)與香農(nóng)-威爾指數(shù)存在類似規(guī)律。表明功能菌定殖能夠提高黑麥草內(nèi)生細(xì)菌種群多樣性和均勻度，降低芘污染對(duì)黑麥草內(nèi)生細(xì)菌種群多樣性的影響。

表3 黑麥草根和莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌種群分析Table 3 Populations of endophytic bacteria in ryegrass seedlings

芘污染和菌株P(guān)W7定殖還會(huì)影響黑麥草根和莖葉可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)種屬，影響內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。從表3可知，未接菌組中，芘污染黑麥草根中優(yōu)勢(shì)種屬由Micrococcus屬和Rhizobium屬變?yōu)镻an?toea屬，芘污染黑麥草莖葉中絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種屬由Curto?bacterium屬變?yōu)镸icrobacterium屬。相同芘污染水平下，菌株P(guān)W7接種后，黑麥草根部Serratia屬成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種屬（LR0.5中為略優(yōu)勢(shì)種屬），黑麥草莖葉部?jī)?yōu)勢(shì)種屬中的Chryseobacterium屬變?yōu)镻antoea屬（LS0.1、LR0.1）、Pseudomona屬（LS0.5）和Sphingobacte?rium屬（LR0.5）。

對(duì)比表3中不同處理組黑麥草根和莖葉部?jī)?yōu)勢(shì)菌株的芘降解效能發(fā)現(xiàn)，黑麥草內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌株均對(duì)芘具有一定的降解能力，其中菌株P(guān)YRL3（Erwinia）、PYRL11（Serratia）、PYRL14（Rhizobium）、PYRL15（Sphin?gobacterium）、PYRL18（Curtobacterium）、PYRL19（Kocu?ria）、PYRL24（Micrococcus）對(duì)20 mg·L-1芘的15 d降解率超過55%。在芘污染條件下，定殖黑麥草內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌株芘降解能力普遍高于未接菌黑麥草內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌株，表明菌株P(guān)W7定殖能夠通過改變黑麥草內(nèi)群落組成提高植物中芘去除能力。此外，各處理組根部?jī)?yōu)勢(shì)菌株芘降解能力普遍高于莖葉中優(yōu)勢(shì)菌，表明根是黑麥草生物降解芘的主要部位。

3 討論

功能內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)的定殖效率是其發(fā)揮生物防治作用的關(guān)鍵因素[26]。本研究中接菌處理后定殖在黑麥草根和莖葉部的定殖菌株P(guān)W7數(shù)量達(dá)103～107CFU·g-1，表明菌株P(guān)W7能夠成功定殖在黑麥草組織中并能良好生存和繁殖。菌株P(guān)W7的高效定殖有利于降低植物芘污染和促進(jìn)植物生長(zhǎng)。相關(guān)性分析表明：在芘污染條件下，黑麥草體內(nèi)功能菌定殖數(shù)量與植株生長(zhǎng)增量顯著正相關(guān)（根中ρ=0.647，P=0.031；莖葉中ρ=0.661，P=0.038）；特別是芘污染下黑麥草體內(nèi)功能菌定殖數(shù)量與植株中芘污染去除也顯著正相關(guān)（根中ρ=0.879，P=0.01；莖葉中ρ=0.655，P=0.029）。研究表明，內(nèi)生細(xì)菌的定殖效率受很多因素影響，除植物自身因素[27]、內(nèi)生細(xì)菌基因組[28]等因素外，定殖方式也會(huì)影響功能內(nèi)生細(xì)菌的定殖效率。Afzal等[6]采用4種定殖方式將內(nèi)生細(xì)菌Burkholderia phytofirmans PsJN接種到柴油污染地區(qū)的黑麥草體內(nèi)，結(jié)果表明，PsJN菌株灌根接種的定殖效率最高，表現(xiàn)出最佳的生防效果。本研究結(jié)果也證實(shí)相比浸種接種，浸根接種黑麥草的菌株P(guān)W7定殖效率更高，降低芘污染風(fēng)險(xiǎn)的效果更好。

隨著芘污染濃度的增大，黑麥草根中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量顯著減少，莖葉中的數(shù)量在低濃度增加，在高濃度減少，且變化顯著。Liu等[29]的研究結(jié)果也表明隨著菲污染濃度的升高，小麥根中內(nèi)生細(xì)菌總數(shù)減少，莖葉中先增后減。說明低濃度PAHs污染能促進(jìn)植物莖葉中內(nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)，高濃度表現(xiàn)出抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)W7定殖提高了高濃度芘污染下黑麥草根和莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量，而且可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量與功能菌定殖效率有關(guān)，相關(guān)性分析表明根中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量與功能菌定殖效率呈正相關(guān)關(guān)系（ρ=0.681，P=0.015），且根中內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量增加與植物體內(nèi)芘污染去除顯著正相關(guān)（ρ=0.668，P=0.035）。這些結(jié)果說明，菌株P(guān)W7也可通過提高植物體內(nèi)總可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量降低植物體內(nèi)芘污染。

本研究分別從黑麥草體內(nèi)分離出21屬共32株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，分別屬于Gammaproteobacteria、Alpha?proteobacteria、Betaproteobacteria、Actinobacteria、Ba?cilli和Flavobacteria 6個(gè)綱，表現(xiàn)出植物內(nèi)生菌群豐富的多樣性。豐富多樣的內(nèi)生細(xì)菌有利于促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高抗逆性。高濃度PAHs污染能夠降低微生物多樣性，Wang等[30]研究表明在高濃度PAHs污染下沉積物中細(xì)菌多樣性顯著下降，而Cravo-Laureau等[31]認(rèn)為菌群多樣性降低會(huì)嚴(yán)重影響污染物的降解。通過多樣性指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，高濃度芘污染能夠降低植物內(nèi)生細(xì)菌的多樣性和均勻度，但菌株P(guān)W7浸根和浸種定殖均能有效提高黑麥草根和莖葉中內(nèi)生細(xì)菌的多樣性和均勻度，緩解了芘污染對(duì)植物內(nèi)生細(xì)菌多樣性的破壞作用。這結(jié)果與Afzal等[6]的研究一致，表明利用植物與內(nèi)生細(xì)菌聯(lián)合作用是修復(fù)有機(jī)物污染的有效方法。

盛月慧等[23]將5種濃度菲作用于黑麥草后發(fā)現(xiàn)，根、莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌種群發(fā)生了不同程度的改變，植物內(nèi)生細(xì)菌能對(duì)有機(jī)物污染做出響應(yīng)。而菌株P(guān)W7定殖能使芘污染黑麥草根和莖葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌群落組成產(chǎn)生明顯變化，改變植物優(yōu)勢(shì)種屬，增強(qiáng)對(duì)有機(jī)污染物的代謝能力。芘降解菌株P(guān)W7定殖后其所屬的Serratia屬成為黑麥草根中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)屬，其他優(yōu)勢(shì)屬Pantoea屬、Micrococcus屬和Erwinia屬也表現(xiàn)出較高的芘降解潛能。宋立超等[14]用菌株P(guān)antoea sp.TJB5胞內(nèi)酶對(duì)50 mg·L-1菲處理12 h的降解率達(dá)到70.1%。Nida等[32]將Micrococcus屬細(xì)菌制成菌蠟球用于石油烴降解。定殖處理后芘污染黑麥草莖葉中的優(yōu)勢(shì)屬M(fèi)icrobacterium屬[33]、Pantoea屬、Pseudomona屬[15]和Sphingobacterium屬[16]也均被報(bào)道過具有芳香烴降解潛能。Phillips等[15]研究紫花苜蓿內(nèi)生細(xì)菌群落與芳香烴污染降解能力的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Pseudomonas屬存在時(shí)，植物烷烴代謝能力提高，而當(dāng)Pseudomonas屬和Brevundimonas屬共同存在時(shí)，植物芳香烴的代謝能力提高。功能菌定殖后這些具有芘降解潛能的屬成為植物中的優(yōu)勢(shì)屬，提高了植物代謝芘的能力，降低了植物和環(huán)境中芘的污染風(fēng)險(xiǎn)。此外，浸根和浸種處理黑麥草內(nèi)生細(xì)菌群落組成的差異可能是兩種定殖方式的定殖效率不同造成的。

綜上所述，明確功能內(nèi)生細(xì)菌定殖對(duì)植物生長(zhǎng)量、體內(nèi)芘含量及內(nèi)生細(xì)菌群落的影響，有助于利用內(nèi)生細(xì)菌調(diào)控植物對(duì)PAHs的吸收和代謝，篩選更多具有高效降解潛能的內(nèi)生細(xì)菌，完善有機(jī)污染物的植物-微生物聯(lián)合修復(fù)方法，進(jìn)而有效規(guī)避有機(jī)物污染區(qū)作物的污染風(fēng)險(xiǎn)。然而，功能內(nèi)生細(xì)菌定殖對(duì)植物內(nèi)生細(xì)菌種群的影響機(jī)制和定殖方式的影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

（1）芘降解內(nèi)生細(xì)菌PW7能高效定殖在黑麥草根和莖葉中，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高芘污染黑麥草根和莖葉中內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量和多樣性，改變黑麥草內(nèi)生細(xì)菌群落組成，進(jìn)一步提高了植物中芘的代謝能力，顯著降低了植物芘污染。

（2）浸根與浸種兩種定殖方式均為有效可行的定殖修復(fù)方式，相比浸種定殖，具有更高定殖效率的浸根定殖表現(xiàn)出更顯著的促生作用、菌群改變和減芘效果。關(guān)于定殖方式對(duì)內(nèi)生菌群及芘污染去除的影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

（3）功能菌浸根和浸種定殖是高效的有機(jī)物環(huán)境污染植物-微生物聯(lián)合修復(fù)方法，能有效規(guī)避污染區(qū)作物污染風(fēng)險(xiǎn)，為更多功能菌株的發(fā)現(xiàn)和微生物菌種在污染修復(fù)中的應(yīng)用提供依據(jù)和參考。