郭瞻宇，張子楊，蔣亞輝，Altaf Hussain Lahori，張增強(qiáng)，李榮華

（西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

近年來，由于工業(yè)含鎘（Cd）“三廢”的大量排放以及污水灌溉等造成了大面積農(nóng)田土壤不同程度的Cd污染[1-2]。據(jù)2014年《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》顯示，Cd的污染點(diǎn)位超標(biāo)率達(dá)7.0%，居無機(jī)污染物的榜首[3]。而2016年5月頒布的《土壤污染防治行動計劃》要求：到2020年，我國污染地塊安全利用率達(dá)到90%以上。因此對Cd污染區(qū)土壤的安全利用及生態(tài)修復(fù)已迫在眉睫。

目前，國內(nèi)外眾多學(xué)者圍繞超富集植物的篩選及其對重金屬的富集、轉(zhuǎn)運(yùn)等進(jìn)行了大量的研究和探索[4-6]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的Cd超富集植物有遏藍(lán)菜（Thlaspi caerule?scens L.）[7]、龍 葵（Solanum nigrum L.）[8]、印 度 芥 菜（Brassica juncea L.）[9]、東南景天（Sedum alfredii H.）[10]等。龍葵地上部分Cd含量可達(dá)387 mg·kg-1[8]；東南景天主要是Zn超富集植物，然而Cd、Zn的化學(xué)性質(zhì)相似，因此也可吸收較高含量Cd[10]。盡管這些超富集植物可以吸收大量的Cd，可是由于生長緩慢，植株矮小，很難應(yīng)用于污染土壤的工程修復(fù)。印度芥菜雖然生物量較大且地上部分Cd含量可達(dá)376 mg·kg-1[9]，但其對氣候較為敏感，具有很強(qiáng)的地域性[11]，在我國難以大面積種植。我國芥菜品種資源豐富，生物量大、生長期短、適應(yīng)性強(qiáng)，而且印度芥菜是芥菜的近緣植物。因此從我國現(xiàn)有的芥菜資源中篩選出耐性強(qiáng)、吸收率高的品種，對我國Cd污染土壤的植物修復(fù)具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

物種敏感性分布（SSD）是基于一系列物種或相同物種的不同品種間對某一種污染物敏感性差異提出來的一種生態(tài)風(fēng)險評價方法，可用于在一定的污染條件下，計算保護(hù)大多數(shù)生物物種安全的污染物濃度值。該方法假設(shè)不同物種或相同生物不同種類的毒性數(shù)據(jù)能被某概率分布函數(shù)所擬合，計算出重金屬對受試物種所產(chǎn)生的脅迫程度，以確定風(fēng)險最大的物種類別，并體現(xiàn)出物種的敏感性差異[12-13]。目前關(guān)于Cd脅迫下植物敏感性分布差異報道較少。因此，研究Cd脅迫對不同品種芥菜的敏感性分布，篩選出具有修復(fù)Cd污染土壤潛力的芥菜品種，具有重要的理論和實(shí)際價值。

本文以國內(nèi)市場最為常見的21個芥菜品種為研究對象，對其在Cd脅迫下的劑量-效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行擬合，在此基礎(chǔ)上，計算不同品種芥菜對Cd的敏感性分布，并對篩選出的兩個代表性芥菜品種體內(nèi)抗氧化酶活性和Cd含量進(jìn)行測定分析，以期科學(xué)地篩選出對Cd耐性強(qiáng)且吸收率較高的芥菜品種，并了解其抗氧化機(jī)制，為土壤Cd污染區(qū)植物修復(fù)提供理論與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤采集于陜西省鳳縣某鉛鋅冶煉廠（33°56′N，106°32′E）附近農(nóng)田的0～20 cm耕層褐土，將采集的土壤自然風(fēng)干后，去除石礫、殘渣等雜物，過2 mm尼龍篩備用。為便于描述，按土壤Cd含量高低，分別將獲得的土壤樣品記作T0、T1、T2、T3、T4和T5。研究中，同時取少量土壤過0.15 mm和0.25 mm篩，用于土壤常規(guī)分析及Cd含量測定，測定方法見《土壤農(nóng)化分析》[14]，其理化性質(zhì)見表1。T0為無污染，T1～T5這5種土壤中Cd含量均超過《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》的限制，其中T1為輕度污染，T2為中度污染，T3、T4、T5為重度污染。

表1 土壤基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physicochemical properties of the tested soils

供試芥菜購自國內(nèi)多個蔬菜種子公司（表2），品種發(fā)芽率≥90%，純度≥95%。

表2 供試芥菜代號、品種及其產(chǎn)地Table 2 The code，name and origin of test materials

1.2 試驗設(shè)計

本試驗于2017年5—7月在西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院旱棚內(nèi)進(jìn)行。為保證各處理間養(yǎng)分含量相同且滿足植物生長需要，對T0～T5的6種土壤施入尿素、磷酸氫鈣和氯化鉀，使各處理養(yǎng)分在同一水平（N 100 mg·kg-1、P 120 mg·kg-1、K 350 mg·kg-1）。取 3 kg（以干質(zhì)量計）事先處理好的土壤裝入塑料花盆中（高25 cm、直徑20 cm）。將上述芥菜品種種子用10%H2O2消毒15 min，然后用去離子水沖洗干凈后，挑選籽粒飽滿的芥菜種子播種，每盆播種20粒，待植株生長至3片真葉時，間苗至6株，種植期間將土壤含水量保持在田間持水量的70%，及時去除蟲害和雜草。每個品種每個處理均重復(fù)3次。種植50 d后，選取3株植物，各選部位、長勢、葉齡一致的有代表性的葉子，剪碎混勻測定分析抗氧化酶活性，最后每盆定苗3株，在種植第60 d收獲。收獲時先用自來水將完整的芥菜植株沖洗干凈，再用EDTA-2Na浸泡植株根系30 min，以去除根系表面的可交換態(tài)Cd，最后經(jīng)去離子水完全沖洗后用吸水紙擦干，并將芥菜分為根和地上部分裝入信封。

1.3 指標(biāo)測定

用105℃烘干稱重法進(jìn)行芥菜生物量測定。芥菜植株的丙二醛（MTA）含量測定采用硫代巴比妥酸法，超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍(lán)四唑法，過氧化氫酶（CAT）活性測定采用比色法，過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[15]。參照《土壤農(nóng)化分析》將芥菜植株用HNO3-H2O2微波消解后，利用石墨爐原子吸收分光光度計（Hitachi Z-3000，日本）進(jìn)行Cd含量測定。同時以國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GSB 04-1721—2004，GBW 08502）進(jìn)行分析質(zhì)量控制，所有植物樣品的Cd回收率均大于95%。按照下列公式計算芥菜植株中Cd的富集系數(shù)（BCF）和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（TF）。

富集系數(shù)（BCF）=植株地上部Cd含量或根部Cd含量/土壤Cd含量

轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（TF）=植株地上部Cd含量/植株根部Cd含量

凈化率=植株Cd積累量/土壤有效Cd總量×100%

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

1.4.1 劑量-效應(yīng)曲線擬合

采用邏輯斯蒂克分布模型（Log-logistic distribu?tion）對不同品種芥菜Cd脅迫的劑量-效應(yīng)曲線進(jìn)行擬合，已有研究表明此模型能較好地擬合重金屬及抗生素等對植物的劑量-效應(yīng)關(guān)系[16]：

式中：y為各Cd處理水平芥菜干質(zhì)量與T0處理的芥菜干質(zhì)量的比值，%；y0、b為擬合參數(shù)；x為不同處理中Cd的濃度值，mg·kg-1；M為EC50的自然對數(shù)值。

當(dāng)?shù)蜐舛菴d對芥菜產(chǎn)生刺激效應(yīng)時，采用低劑量效應(yīng)擬合方程（Hormesis dose-effect）進(jìn)行劑量-效應(yīng)曲線擬合[17]，方程如下：

式中：Y是芥菜相對生物量，%；X是土壤中Cd的濃度，mg·kg-1；a、b、c、d是方程參數(shù)。k是與有效抑制濃度相關(guān)的變量，其范圍為0～100，當(dāng)k為50時，參數(shù)c定義為EC50。

1.4.2 芥菜對Cd脅迫的物種敏感性分布（SSD）

在劑量-效應(yīng)測定基礎(chǔ)上，對不同品種芥菜Cd的半抑制毒性閾值濃度（EC50）進(jìn)行對數(shù)變換后，利用概率函數(shù)模型（Burr-Ⅲ）進(jìn)行不同品種芥菜Cd脅迫的物種敏感性分布曲線擬合[12]：

式中：x為土壤中Cd的濃度，mg·kg-1；b、c、k為函數(shù)的3個參數(shù)。該方法利用澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)和工業(yè)研究組織提供的計算軟件Burrlioz來完成。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Origin 2016軟件進(jìn)行繪圖，應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和P＜0.05水平下的Duncan檢驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同品種芥菜對Cd脅迫的劑量-效應(yīng)關(guān)系

圖1 不同品種芥菜對Cd脅迫的劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線Figure 1 Dose-effect curves of different mustard cultivars under Cd stress

劑量-效應(yīng)關(guān)系是指作用于個體或群體的外源化學(xué)物質(zhì)的劑量與其引起的生物效應(yīng)強(qiáng)度之間的相互關(guān)系。如圖 1 所示，在低濃度 Cd（T1，1.23 mg·kg-1）時，除了JTN、JT-F1、CC、FJ-388以外，其余17種芥菜生長均表現(xiàn)出一定的毒性刺激（Hormesis）效應(yīng)，與T0相比，生物量增加了2.0%～30.5%，并且植株葉子翠綠、莖稈粗壯。隨著土壤中Cd濃度的升高，芥菜相對生物量均降低。當(dāng)土壤Cd含量達(dá)到最大（T5，43.90 mg·kg-1）時，Cd對芥菜的生長抑制最為明顯。姚詩音等[18]研究發(fā)現(xiàn)1 mg·kg-1Cd處理可以促進(jìn)青葙（Celosia argentea L.）的生長，其生物量較對照組顯著增加且達(dá)到最大值。Sidhu等[19]也發(fā)現(xiàn)低濃度Cd處理能增加臭薺（Coronopus didymus L.）的生物量和根長。這可能是由于植物在低濃度Cd脅迫下應(yīng)激產(chǎn)生保護(hù)作用，通過加速生理生化活動，產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物，提高了植物體內(nèi)的抗氧化酶活性，從而促進(jìn)植物生長。通過劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線，計算出21種芥菜Cd的EC50及其95%置信區(qū)間（表3）。由表3可知，Cd對上述21種芥菜的 EC50變化范圍為 12.16～52.72 mg·kg-1，相差3.34倍。JTN的EC50值為12.16 mg·kg-1，而BJ的EC50值為52.72 mg·kg-1。

2.2 芥菜對Cd脅迫的物種敏感性分布

物種敏感性分布（SSD）法摒棄了以往單一物種、單一污染物的評價模式，評價結(jié)果較準(zhǔn)確，已有研究證明實(shí)驗室與野外圍隔試驗所獲得的毒理數(shù)據(jù)沒有明顯差異[20]。針對SSD曲線的構(gòu)建，不同學(xué)者提出了不同的參數(shù)擬合方法。王小慶等[21]通過使用Burr-Ⅲ、Log-normal、Log-logistic、Weibull及 Gamma 5種常用函數(shù)分別擬合酸性、中性、堿性及石灰性土壤中不同物種對銅脅迫的SSD曲線，發(fā)現(xiàn)Burr-Ⅲ擬合效果穩(wěn)定且精確度較高。劉亞莉等[22]利用不同分布函數(shù)擬合敵敵畏對水生生物的SSD曲線時，同樣發(fā)現(xiàn)Burr-Ⅲ擬合效果最好。

表3 基于生物量的芥菜Cd半抑制毒性閾值濃度（EC50）及95%置信區(qū)間（mg·kg-1）Table 3 Toxicity thresholds of Cd to mustard cultivars based on biomass response and their 95%confidence intervals（mg·kg-1）

本實(shí)驗對上述不同品種芥菜EC50進(jìn)行對數(shù)變化后，利用Burr-Ⅲ概率函數(shù)模型對不同品種芥菜Cd脅迫的SSD曲線進(jìn)行擬合（圖2）。不同品種芥菜對Cd脅迫的敏感性分布順序為BJ＞HJ＞TJ-381＞BJ-3111＞JT-F1＞SY-16＞W(wǎng)J＞DJ＞CC-602＞FJ-002＞BJ-338＞KTJ＞SJ＞TJ-391＞JXJ＞JSC＞CC＞XXJ＞FJ-388＞ZX＞JTN，表明21種芥菜對Cd脅迫的敏感性分布具有明顯差異。其中JTN對于Cd脅迫最敏感，而BJ表現(xiàn)出最強(qiáng)的耐性。Ding等[23]研究發(fā)現(xiàn)，SSD曲線能很好地描述12種根莖類蔬菜對鉛的敏感性，并發(fā)現(xiàn)馬鈴薯在鉛污染的紅壤及潮土中耐性最強(qiáng)。雷麗萍等[24]同樣利用SSD法在16種南方主栽煙草中，篩選出了適宜植煙區(qū)Cd污染種植的耐性煙草品種。

圖2 不同品種芥菜基于EC50的物種敏感性分布曲線Figure 2 Cumulative frequencies of species sensitivity distributions（SSD）of the different mustard cultivars based on EC50

2.3 Cd脅迫下芥菜體內(nèi)MDA含量和抗氧化酶活性變化

為了深入探討不同敏感性品種在Cd脅迫下的抗氧化系統(tǒng)響應(yīng)機(jī)制，本試驗選取JTN、BJ這兩種對Cd敏感性具有顯著差異的芥菜品種，對其體內(nèi)MDA含量和抗氧化酶活性進(jìn)行測定。

通常情況下，植物細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡，但當(dāng)植物受到外界Cd脅迫時，這一平衡受到破壞，過量ROS會導(dǎo)致植物細(xì)胞膜系的功能和結(jié)構(gòu)遭到破壞。MDA是膜脂過氧化的重要產(chǎn)物，其含量的高低是判斷植物細(xì)胞膜受害程度、抵抗不良環(huán)境強(qiáng)弱的一個重要指標(biāo)[25]。試驗結(jié)果表明（圖3A），土壤中Cd含量較低時（T1），耐性品種BJ體內(nèi)MDA含量較T0減少了38.3%，這可能與BJ在低濃度Cd脅迫下，表現(xiàn)出的毒性刺激效應(yīng)有關(guān)。隨著Cd含量的升高，兩種芥菜MDA含量都顯著升高（P＜0.05），但BJ的MDA含量顯著低于JTN，表明Cd深刻影響著芥菜體內(nèi)膜脂過氧化作用，且Cd對敏感性品種的影響要強(qiáng)于對耐性品種的影響。BJ和JTN體內(nèi)MDA含量在T5時達(dá)到峰值，分別比T0增加了86.1%、407.0%，這與邵國勝等[26]和李冬琴等[27]研究結(jié)果一致。表明高濃度的Cd加劇芥菜體內(nèi)膜脂過氧化，促進(jìn)MDA積累，而且Cd脅迫對不同基因型芥菜體內(nèi)MDA含量的影響存在顯著差異，以敏感性品種受影響最大。

植物體內(nèi)的SOD、CAT和POD等抗氧化酶組成了一個有效的活性氧清除系統(tǒng)，能夠有效清除活性氧自由基，減緩細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害，使植物適應(yīng)逆境環(huán)境。SOD可將分解為H2O2和O2，是清除活性氧的第一道防線。如圖3B所示，低濃度Cd脅迫下（T1），BJ體內(nèi)SOD活性與T0相比差異不顯著（P＞0.05），隨著Cd含量增加到T2時，SOD活性顯著升高，達(dá)到峰值，隨后表現(xiàn)出下降趨勢，雖然T4較T3略有增高，但差異不顯著（P＞0.05）。BJ的SOD顯著高于JTN，表明耐性品種由于自身的保護(hù)能力，具有較高的SOD活性，從而降低了體內(nèi)活性氧自由基對細(xì)胞膜膜脂過氧化作用的傷害。這也佐證了前述的BJ體內(nèi)MDA含量較JTN低這一結(jié)論。JTN體內(nèi)SOD活性隨著Cd濃度的增加顯著下降（P＜0.05），在T5時最為嚴(yán)重，較T0低53.9%，表明Cd脅迫對敏感型品種已造成嚴(yán)重傷害，其自身對Cd脅迫的緩解作用有限。

POD和CAT在植物呼吸代謝和植物逆境脅迫中起著重要作用，可以將植物體內(nèi)H2O2進(jìn)行氧化分解，減緩自由基對植物的傷害[28]。在Cd脅迫下，兩種芥菜POD活性均隨Cd濃度增加呈先增后減的趨勢（圖3C）。JTN與BJ分別在T1、T2下達(dá)到峰值，分別是T0的1.5、1.7倍。兩種芥菜CAT活性呈不同的變化趨勢（圖3D），BJ體內(nèi)CAT活性表現(xiàn)出先增后降的趨勢，在T1時達(dá)到峰值，相比T0增加了70.1%；JTN則表現(xiàn)下降的趨勢，T5比T0下降了69.9%。史靜等[29]對Cd脅迫下不同水稻品種抗氧化酶研究也得出類似的結(jié)論。據(jù)此可以認(rèn)為，耐性品種體內(nèi)較高的抗氧化酶，有效抵抗了Cd脅迫造成的過氧化脅迫，從而減輕了活性氧對細(xì)胞膜的傷害，減緩了膜脂過氧化反應(yīng)。但植物耐受Cd的機(jī)制除抗氧化酶系統(tǒng)作用外，還受多種生理變化和遺傳因子調(diào)控，所以還應(yīng)對其進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.4 不同品種芥菜對Cd的吸收積累特征

植物體內(nèi)的Cd含量是篩選植物修復(fù)資源的重要指標(biāo)之一。由表4可知，在T0條件下，僅BJ的根部檢測到Cd，其含量僅為0.36 mg·kg-1。隨著土壤中Cd濃度的升高，兩種芥菜根部和地上部Cd含量均顯著升高，且耐性品種BJ地上部和根部均顯著高于敏感性品種JTN。特別是在T5條件下，BJ地上部和根部Cd含量分別達(dá)到68.85 mg·kg-1和77.29 mg·kg-1，是 JTN的3.1倍和2.5倍。這表明耐性品種BJ具有良好的Cd吸收能力。Liu等[30]對在Cd脅迫下的40種白菜進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，耐性白菜品種對Cd的吸收能力較弱，可以作為低積累安全品種種植。本研究結(jié)果與之不一致，這可能是由于植物對Cd吸收及耐受能力與植物品種的基因型有很大關(guān)系[31-32]，即便是耐性植物對重金屬的吸收積累能力也不同[33-34]。

圖3 Cd脅迫對兩種芥菜MDA含量和抗氧化酶活性的影響Figure 3 Effect of Cd stress on malondialdehyde content and antioxidant enzyme activities of two mustard cultivars

富集系數(shù)（BCF）和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（TF）分別反映了植物各部位對土壤中重金屬的富集能力和重金屬從根部向地上部分的遷移能力。通過表4分析可知，隨著土壤Cd含量的增加，兩種芥菜BCF基本呈下降趨勢，但耐性品種BJ的BCF始終大于1，且明顯大于敏感性品種，說明耐性品種BJ對Cd的富集能力較強(qiáng)。BJ地上部分和根部的BCF分別在T1、T2處理達(dá)到最大3.25和3.06，但其與Cd超富集植物龍葵[8]、印度芥菜[35]相比較小，這是因為本試驗中采用的是自然污染土壤，其Cd有效態(tài)含量較低，僅為Cd全量的10%左右。敏感性品種JTN的TF在T1～T5處理下均小于1，這可能是由于敏感型品種根部對Cd的固定和區(qū)隔化，使得只有少部分Cd能通過木質(zhì)部導(dǎo)管運(yùn)輸至地上部，從而減緩Cd對植物地上部分的脅迫。而耐性品種僅在最高Cd濃度（T5）下TF才小于1，這可能是因為高濃度脅迫已經(jīng)超出了植物耐受能力，導(dǎo)致植物轉(zhuǎn)運(yùn)Cd的能力下降。但我國90%以上的Cd污染土壤為中輕度污染（Cd≤1.5 mg·kg-1）[3]，BJ的耐受能力可以符合土壤修復(fù)需要。

Cd積累量反映了植物吸收儲存Cd的能力，其大小與植株生物量和植株Cd含量有直接的關(guān)系。本試驗中，在高濃度Cd處理下（T5），BJ的地上部Cd積累量達(dá)156.03 μg·株-1（表5），已經(jīng)超過Cd超富集植物龍葵（142 μg·株-1）[8]。凈化率可作為重金屬污染土壤植物修復(fù)效率的綜合指標(biāo)[35]。從表5兩種芥菜生長60 d后的盆栽試驗土壤凈化率可以看出，BJ地上部分及總凈化率在T3時達(dá)到最大值，分別為11.0%和12.2%，高于蘇德純等[35]對印度芥菜、范洪黎等[36]對莧菜及唐皓等[37]對高積累水稻的相關(guān)研究。雖然本文篩選的耐性芥菜BJ并未達(dá)到Cd超富集植物的標(biāo)準(zhǔn)，但其生長周期短，具有較大生物量，自身對Cd具有較高耐性、積累量和凈化率，說明耐性植物BJ在修復(fù)Cd污染土壤中具有一定的應(yīng)用潛力。

表4 Cd脅迫下兩種芥菜的Cd含量、轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（TF）和富集系數(shù)（BCF）（均以干質(zhì)量計算）Table 4 Cd content，bioconcentration factor and translocation factor of two mustard cultivars under Cd stress（calculated by dry weight）

表5 Cd脅迫下兩種芥菜對Cd的積累量及對污染土壤的凈化能力（均以干質(zhì)量計算）Table 5 Cd accumulation and purification rate by two mustard cultivars under Cd stress（calculated by dry weight）

3 結(jié)論

（1）21個芥菜品種對Cd脅迫的敏感性分布具有顯著性差異，其中JNT對Cd脅迫最為敏感，BJ則表現(xiàn)出最強(qiáng)耐性。

（2）Cd處理下，BJ與JTN受到了氧化脅迫，耐性品種BJ體內(nèi)抗氧化酶（SOD、CAT、POD）的協(xié)同作用高于敏感性品種JTN，從而減緩了Cd脅迫下活性自由基對其生物膜的傷害。

（3）隨土壤Cd濃度的增大，不同品種芥菜根部和地上部Cd含量均呈增加趨勢，耐性品種BJ富集系數(shù)大于1，地上積累量最大可達(dá)156.03 μg·株-1，Cd凈化率最大為11.0%，說明耐性品種BJ對Cd有較好的吸收凈化能力，用于修復(fù)Cd污染土壤具有一定潛力。