許 晴 劉麗娜 宋妍婷 曲愛(ài)娟

(1.首都醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室, 北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系 重塑相關(guān)心血管疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 代謝紊亂相關(guān)心血管疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

動(dòng)脈僵硬度升高是心血管疾病發(fā)病和死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因子[1]。臨床上，動(dòng)脈僵硬度的改變被認(rèn)為發(fā)生在心血管疾病之前。因此，評(píng)估動(dòng)脈僵硬度可以預(yù)測(cè)并最終預(yù)防心血管疾病[2]。脈搏波傳導(dǎo)速度(pulse wave velocity，PWV)是無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)動(dòng)脈僵硬度的最常用指標(biāo)[3]。超聲影像學(xué)二維斑點(diǎn)追蹤技術(shù)(2D-speckle tracking，2D-ST)為近年來(lái)發(fā)展的一種定量、客觀的測(cè)量心血管生物力學(xué)的技術(shù)，可無(wú)創(chuàng)傷定量評(píng)價(jià)局部心肌運(yùn)動(dòng)及功能，尤其是可以在整體功能改變前先發(fā)現(xiàn)節(jié)段功能異常，并能定量分析血管力學(xué)[4]。目前，該技術(shù)已應(yīng)用于科研小動(dòng)物心血管超聲檢測(cè)領(lǐng)域。載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因敲除(ApoE-/-)小鼠可自發(fā)形成動(dòng)脈粥樣硬化, 是動(dòng)脈粥樣硬化研究常用模型。本研究利用超高頻超聲2D-ST技術(shù)分析ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈僵硬度的相關(guān)指標(biāo)，探索評(píng)估小鼠頸總動(dòng)脈管壁僵硬度特征的可行性，探討正常小鼠與ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈僵硬度的差別，同時(shí)為相關(guān)課題的研究提供準(zhǔn)確的影像學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用C57B1 /6J 雄性小鼠，8周齡，6只，體質(zhì)量(24.48±1.59)g。載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因敲除(ApoE-/-)雄性小鼠，60周齡，6只，體質(zhì)量(27.7±1.06)g。北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格許可證編號(hào)：SCXK(京)2016-0006。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 儀器

應(yīng)用超高分辨率小動(dòng)物彩色多普勒超聲成像系統(tǒng)(Vevo 2100 Imaging System, FUJIFILM VisualSonics Inc., 美國(guó))，MS-700高頻寬帶電子線陣探頭。探頭中心頻率50 MHz；軸向分辨力和橫向分辨力分別為30 和75 μm。超聲波速度1 540 m/s。

1.2.2 小鼠血壓測(cè)量

采用無(wú)創(chuàng)尾套法(美國(guó)Visitech System BP-2000血壓儀)進(jìn)行血壓測(cè)量。實(shí)驗(yàn)前1周每日固定時(shí)間訓(xùn)練小鼠鉆籠，正式實(shí)驗(yàn)時(shí)每日在相同時(shí)間盡量以相同方式相同操作進(jìn)行血壓測(cè)定，待小鼠狀態(tài)穩(wěn)定后，每只實(shí)驗(yàn)小鼠每次重復(fù)測(cè)量連續(xù)穩(wěn)定的血壓5次，記錄收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)、平均動(dòng)脈壓(mean blood pressure, MBP)、心率(heart rate, HR)值和血壓波形圖并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 2D-ST技術(shù)評(píng)價(jià)血管僵硬度

將小鼠放入麻醉誘導(dǎo)箱內(nèi)，調(diào)節(jié)氧氣至1L/min，調(diào)節(jié)異氟烷(the Isoflurane，魯南貝特制藥有限公司)至2.5%。當(dāng)小鼠麻醉后，輕輕取出動(dòng)物，使之仰臥位于小鼠專用操作臺(tái)(Mice Handling and physiological Monitoring Platform)，將小鼠的鼻口部置于麻醉面罩內(nèi)，調(diào)節(jié)異氟烷的維持量為1.0%～1.5%。使用脫毛膏脫去小鼠頸部的毛發(fā)。探頭切記朝向小鼠下顎，縱向掃查以確定左頸動(dòng)脈位置。清晰顯示頸動(dòng)脈，調(diào)整探頭，使超聲束垂直于左頸總動(dòng)脈前后壁，顯示血管前、后壁的內(nèi)中膜。在二維超聲模式下，啟動(dòng)EKV(ECG-based Kilohertz Visualization)模式，調(diào)整參數(shù)，存儲(chǔ)左頸動(dòng)脈長(zhǎng)軸觀EKV二維動(dòng)態(tài)圖像。同時(shí)記錄心電圖。在采集圖像期間，調(diào)整麻醉深度。所有圖像均經(jīng)有效數(shù)據(jù)存儲(chǔ)以備線下分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

將存儲(chǔ)的EKV二維動(dòng)態(tài)圖像導(dǎo)入VevoLAB離線工作站，使用血管應(yīng)變專用分析軟件VevoVasc進(jìn)行分析(版本3.1.1，F(xiàn)UJIFILM VisualSonics Inc., 美國(guó))。在獲取的頸動(dòng)脈長(zhǎng)軸觀EKV二維動(dòng)態(tài)圖像上，于舒張末期自頸動(dòng)脈分叉處向近心端手動(dòng)勾畫(huà)血管內(nèi)外膜邊界，調(diào)整取樣厚度，生成包含血管內(nèi)膜、中膜和外膜解剖結(jié)構(gòu)的感興趣區(qū)域。應(yīng)用2D-ST技術(shù)血管壁追蹤檢測(cè)工具跟蹤血管壁的運(yùn)動(dòng)變化。測(cè)量并計(jì)算內(nèi)中膜厚度(intima-media thickness, IMT)、血管平均面積、血管平均直徑及面積變化率和直徑變化率等參數(shù)。輸入血壓值，計(jì)算血管擴(kuò)張性。同時(shí)記錄血管壁整體徑向應(yīng)變隨時(shí)間變化曲線并計(jì)算相應(yīng)數(shù)值。同時(shí)，在頸動(dòng)脈長(zhǎng)軸觀EKV二維動(dòng)態(tài)圖像上手動(dòng)畫(huà)出等長(zhǎng)選框作為感興趣區(qū)域，進(jìn)入M-mode界面，準(zhǔn)確界定ΔT，計(jì)算PWV。上述每一個(gè)數(shù)據(jù)均測(cè)量3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 超聲影像下頸動(dòng)脈形態(tài)學(xué)觀察

應(yīng)用高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)可以清晰顯示小鼠頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈。正常小鼠管壁光滑(圖1A)，ApoE-/-小鼠近頸動(dòng)脈分叉處可見(jiàn)明顯斑塊(圖1B，箭頭所示)。頸動(dòng)脈管壁分為3層，其中內(nèi)膜為中等回聲，外膜為強(qiáng)回聲，內(nèi)外膜之間的中膜為低回聲或無(wú)回聲。M-型超聲影像圖可見(jiàn)相對(duì)聲束遠(yuǎn)場(chǎng)的管壁結(jié)構(gòu)更清晰，與正常小鼠(圖1C)相比，ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈IMT明顯增厚(圖1D)。

2.2 小鼠血壓及血管成像分析

與正常小鼠相比，ApoE-/-小鼠IMT增加，面積變化率和直徑變化率明顯下降，血管擴(kuò)張性顯著降低，詳見(jiàn)表1。

2.3 應(yīng)用超聲二維斑點(diǎn)追蹤技術(shù)分析小鼠頸動(dòng)脈應(yīng)變及脈搏波傳導(dǎo)速度

超聲二維斑點(diǎn)追蹤圖像下，頸總動(dòng)脈結(jié)構(gòu)清晰，可見(jiàn)前壁外膜(紅色)，前壁內(nèi)膜(藍(lán)色)，后壁外膜(綠色)，后壁內(nèi)膜(黃色)(圖2A、B)。血管壁包含很多均勻分布的聲學(xué)斑點(diǎn)，這些聲學(xué)斑點(diǎn)與組織同步運(yùn)動(dòng)。應(yīng)用2D-ST技術(shù)在超聲圖像中辨認(rèn)這些斑點(diǎn)，并追蹤斑點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)，從而得到組織的運(yùn)動(dòng)參數(shù)。以向量的形式顯示血管壁實(shí)時(shí)的運(yùn)動(dòng)方向及運(yùn)動(dòng)速度，兩組小鼠頸動(dòng)脈血管壁各部分以向量形式顯示的運(yùn)動(dòng)速度均一，方向一致(圖2A、B)。C57小鼠應(yīng)變時(shí)間曲線陡峭，峰值明顯(圖2C)。ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈血管壁應(yīng)變時(shí)間曲線趨于平直，應(yīng)變值降低，結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(41.64±8.51)%vsC57小鼠(66.97±10.28)%,n=6,P<0.05](圖2D，圖3)。檢測(cè)結(jié)果顯示，ApoE-/-小鼠與C57正常小鼠相比，脈搏波傳導(dǎo)速度明顯加快[(3.09±0.23)m/svsC57小鼠(1.90±0.37)m/s，n=6,P<0.05](圖3)。

圖1 應(yīng)用超高分辨率超聲影像系統(tǒng)獲得頸動(dòng)脈縱向二維超聲影像圖及M-型超聲影像圖Fig.1 Representative images of longitudinal B Mode and M mode for common, left internal, and external carotid arteries using the Vevo 2100 with the MS-700 at a center frequency of 50 MHzA：longitudinal B mode image for carotid arteries of C57Bl/6J mice；B：longitudinal B mode image for carotid arteries of ApoE-/- mice with the atherosclerotic plaques (red arrow)；C：M mode image for carotid arteries of C57Bl/6J mice；D：M mode image for carotid arteries of ApoE-/- mice with the thickened intima-media (red arrow).

表1 兩組小鼠頸動(dòng)脈常規(guī)超聲參數(shù)及血壓Tab.1 Conventional echocardiographic data in C57B1 /6J or ApoE-/- mice

圖2 應(yīng)用MS-700探頭2D-ST技術(shù)分析小鼠頸總動(dòng)脈血管壁應(yīng)變Fig.2 2D-ST carotid artery global radial strain curves using the Vevo 2100 with the MS-700 at a center frequency of 50 MHzMotion of the vessel wall for C57Bl/6J (A) and ApoE-/- (B) mice with velocity vectors and lines overlaid on B-mode data.Time-dependent graphs of global radial strain for C57Bl/6J (C) and ApoE-/- (D) mice

圖3 ApoE-/-小鼠與C57B1/6J小鼠的應(yīng)變值與PWV值比較Fig.3 Comparison of global radial strain and PWV*P<0.05 vs C57B1/6J group; PWV：pulse wave velocity.

3 討論

血管僵硬度與心血管事件的密切關(guān)系是當(dāng)前臨床研究的重點(diǎn)，可以有效準(zhǔn)確反映動(dòng)脈結(jié)構(gòu)和功能變化[5-6]。2D-ST是一個(gè)全新的超聲定量分析工具，能夠識(shí)別灰度圖像中的特定聲學(xué)標(biāo)記(即斑點(diǎn))，并在整個(gè)心動(dòng)周期中逐幀地跟蹤它們，其優(yōu)點(diǎn)在于它跟蹤的是二維物體，沿著室壁或血管壁的方向，而不是沿著超聲束，不受聲束方向與室壁或血管壁運(yùn)動(dòng)方向之間夾角的影響，是能更準(zhǔn)確反映彈性的方法[7-8]。本研究中，筆者應(yīng)用先進(jìn)的2D-ST技術(shù)對(duì)正常C57小鼠及ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈管壁進(jìn)行自動(dòng)實(shí)時(shí)檢測(cè)和管壁運(yùn)動(dòng)追蹤，從小鼠血管IMT、直徑和面積變化率、擴(kuò)張性、PWV、應(yīng)變等多指標(biāo)對(duì)小鼠頸動(dòng)脈的僵硬度進(jìn)行較全面的精確量化分析和準(zhǔn)確評(píng)估。

小鼠體積小，正常小鼠頸動(dòng)脈直徑只有0.5 mm左右。臨床用超聲探頭無(wú)法滿足小動(dòng)物器官清晰成像的要求。小動(dòng)物專用超高頻超聲影像系統(tǒng)，利用其超高頻超聲波(30.0～82.5 MHz)，分辨率高達(dá)30μm，能夠得到小實(shí)驗(yàn)動(dòng)物器官的清晰圖像。從而使小實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心血管系統(tǒng)超聲檢測(cè)的精確定量分析成為可能[9]。許多小動(dòng)物心血管疾病模型都會(huì)有大血管病變，如高血壓模型、動(dòng)脈粥樣硬化模型等。在以往對(duì)這些模型的超聲測(cè)試中，由于超聲模塊的限制，只能做常規(guī)指標(biāo)的檢測(cè)。如應(yīng)用B型超聲檢測(cè)小鼠血管的切面影像，測(cè)量動(dòng)脈管壁的厚度，管腔的大小，動(dòng)態(tài)觀測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成與消融。應(yīng)用彩色多普勒和脈沖多普勒對(duì)血流量和血流速度等變化的量化分析等。這些超聲檢測(cè)結(jié)果，必須在血管結(jié)構(gòu)發(fā)生改變之后才能有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，開(kāi)發(fā)用于早期診斷血管病變的非侵入性的方法具有重要的臨床意義[10]

ApoE-/-小鼠由于載脂蛋白E 基因敲除，導(dǎo)致在血液循環(huán)過(guò)程中，富含膽固醇的物質(zhì)容易積累。無(wú)論正常或高脂飲食均可形成嚴(yán)重的高脂血癥[11-12]，因而成為理想的動(dòng)脈粥樣硬化常用小鼠。載脂蛋白E 基因敲除小鼠在普通飲食下，早期主要表現(xiàn)為IMT厚度的變化，隨著病程進(jìn)展，動(dòng)脈粥樣硬化程度逐漸加重, 經(jīng)歷了從脂質(zhì)條紋到粥樣斑塊形成這個(gè)典型的動(dòng)脈粥樣硬化病理過(guò)程。因此筆者以研究動(dòng)脈粥樣硬化常用的ApoE-/-小鼠為研究對(duì)象探討了應(yīng)用高分辨率2D-ST技術(shù)評(píng)估血管僵硬度的方法。動(dòng)脈硬化的共同特點(diǎn)是動(dòng)脈管壁增厚變硬、失去彈性和管腔縮小。大動(dòng)脈中所含的彈性纖維比例較大，從而具有較大的彈性。本研究結(jié)果顯示，ApoE-/-小鼠與正常小鼠相比，頸動(dòng)脈IMT明顯增厚，可見(jiàn)斑塊，血管直徑變化率及面積變化率下降，動(dòng)脈彈性降低，血管的擴(kuò)展能力顯著下降，分析原因在于平滑肌細(xì)胞的增生和膠原纖維的增多，取代了彈性纖維，導(dǎo)致血管壁的彈性降低。

本研究中，筆者檢測(cè)了動(dòng)脈僵硬度的指標(biāo)，即檢測(cè)了兩組小鼠的PWV、血管擴(kuò)張性，進(jìn)一步量化小鼠腹主動(dòng)脈僵硬度。動(dòng)脈壁是動(dòng)脈硬化的始發(fā)部位，其功能或結(jié)構(gòu)改變成為篩查早期血管病變的重要靶點(diǎn)[13]。大動(dòng)脈血管具有彈性貯器作用和順應(yīng)性。脈搏波沿動(dòng)脈管壁傳播，主要與血管的順應(yīng)性有關(guān)。PWV是血壓波動(dòng)通過(guò)動(dòng)脈系統(tǒng)內(nèi)給定兩點(diǎn)距離間的傳導(dǎo)速度，與動(dòng)脈擴(kuò)張性和僵硬度密切相關(guān)[14-15]。動(dòng)脈僵硬度又稱動(dòng)脈彈性、動(dòng)脈順應(yīng)性。動(dòng)脈的順應(yīng)性值越大，動(dòng)脈的可擴(kuò)張能力越大。動(dòng)脈硬化發(fā)生時(shí)，血管壁纖維組織不斷增生，血管僵硬度增加，順應(yīng)性逐漸變小，大動(dòng)脈彈性貯器的作用也就相應(yīng)減弱，脈搏波被血管壁吸收減少，因此脈搏波傳導(dǎo)速度加快[16-17]。本研究結(jié)果顯示，ApoE-/-小鼠血管擴(kuò)張性降低，頸動(dòng)脈順應(yīng)性減弱，動(dòng)脈擴(kuò)張性減低，因而PWV增快。上述指標(biāo)均反映了ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈僵硬度增加。

臨床上已有大量應(yīng)用2D-ST技術(shù)進(jìn)行血管結(jié)構(gòu)和功能測(cè)量的研究報(bào)道[18]。由于臨床儀器的限制，實(shí)驗(yàn)小動(dòng)物相關(guān)研究數(shù)據(jù)還非常少。最新的小動(dòng)物高頻超聲2D-ST技術(shù)已允許在徑向測(cè)量血管壁運(yùn)動(dòng)。應(yīng)變被定義為在壓力的作用下伸長(zhǎng)或縮短變化的百分率。垂直于血管壁并使管壁保持一定形態(tài)作用的應(yīng)力被稱作為徑向應(yīng)力，產(chǎn)生徑向應(yīng)變[18]。2D-ST技術(shù)在超聲圖像中辨認(rèn)血管壁上的聲學(xué)斑點(diǎn)，并追蹤斑點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)，應(yīng)用空間與時(shí)間圖像處理算法逐幀追蹤其幾何位置的移動(dòng)[19-21]，是被認(rèn)為能夠更準(zhǔn)確反映血管彈性的方法。本研究中筆者運(yùn)用2D-ST技術(shù)詳細(xì)分析了頸動(dòng)脈在沿血管直徑組織形變的情況。捕獲關(guān)于動(dòng)脈壁在該方向上的特定運(yùn)動(dòng)的信息。研究結(jié)果顯示，40周齡ApoE-/-小鼠頸總動(dòng)脈血管壁整體徑向應(yīng)變減低。說(shuō)明ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈血管壁沿血管壁直徑的方向伸長(zhǎng)或縮短的運(yùn)動(dòng)能力下降。與其直徑及面積變化率降低，擴(kuò)張性降低相一致，即血管彈性降低，僵硬度增加。

本研究應(yīng)用超高頻探頭及能契合實(shí)驗(yàn)小動(dòng)物高心率的專用超聲儀清晰顯示小鼠血管結(jié)構(gòu)及分析其功能，對(duì)應(yīng)用超聲二維斑點(diǎn)追蹤技術(shù)評(píng)價(jià)小鼠頸動(dòng)脈血管壁僵硬度進(jìn)行了有益的探索，證實(shí)了該應(yīng)用的可行性，從血管形態(tài)學(xué)、PWV、血管擴(kuò)張性、血管壁運(yùn)動(dòng)特征等多方面在體無(wú)創(chuàng)檢測(cè)了實(shí)驗(yàn)小動(dòng)物的血管僵硬度，并建立了正常的參考水平。這些參數(shù)均可作為評(píng)價(jià)頸動(dòng)脈彈性的指標(biāo)，該結(jié)果還支持小動(dòng)物高頻超聲可作為在體非侵入性地量化小鼠頸動(dòng)脈應(yīng)變的新興工具。

二維斑點(diǎn)追蹤技術(shù)圖像清晰性的要求較高，首先需保持圖像清晰。其次盡量使頸動(dòng)脈長(zhǎng)軸平行于屏幕，以減少測(cè)量時(shí)調(diào)整取樣框角度，保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。