王宇峰 曹芳 于春梅 夏西洋 戴秀亮 高亭亭 陳莉

[摘要]目的 探討分析體外受精-胚胎移植（IVF-ET）周期中男方精子DNA碎片指數(shù)（DFI）對囊胚發(fā)育的影響。方法 選取本中心2017年1～12月收治的579例進(jìn)行囊胚培養(yǎng)的IVF周期作為研究對象，按照男方DFI檢測值分為低DFI組（DFI<20%，470例）和高DFI組（DFI≥20%，109例），比較兩組的囊胚培養(yǎng)情況。結(jié)果 低DFI組的囊胚形成率高于高DFI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。兩組的可用囊胚率及優(yōu)質(zhì)囊胚率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 DFI低于20%時(shí)進(jìn)行囊胚培養(yǎng)能獲得更多的囊胚，但是在可用囊胚率及優(yōu)質(zhì)囊胚率上卻不能帶來明顯的提高。

[關(guān)鍵詞]精子DNA碎片指數(shù)；體外受精-胚胎移植；囊胚

[中圖分類號] R331 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）11（c）-0110-03

[Abstract] Objective To investigate the influence of sperm DNA fragmentation index （DFI） on development of blastocyst during in vitro fertilization-embryo transfer （IVE-ET） cycle. Methods A total of 579 IVF-ET cycles from January to December 2017 in our center were selected as the research object， and they were divided into the low DFI group （DFI<20%， 470 cases） and the high DFI group （DFI≥20%， 109 cases） based on the value of husband′s DFI， and the development of blastocyst of two groups was analyzed. Results The blastocyst formation rate of the low DFI group was higher than that of the high DFI group （P<0.05）， and the useful blastocyst formation rate and high quality blastocyst formation rate of the two groups were similar， with no significant difference （P>0.05）. Conclusion There will be a higher blastocyst formation rate when the DFI is below 20%， however， the quality of blastocyst will not be improved.

[Key words] Sperm DNA fragmentation index； In vitro fertilization-embryo transfer； Blastocyst

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，對男性不育的認(rèn)識逐漸深入。作為遺傳信息的載體，精子染色質(zhì)完整性對于生育健康后代具有重要意義，而精子DNA碎片指數(shù)（DFI）正是反映精子DNA完整性的一個(gè)重要參數(shù)。囊胚培養(yǎng)及單囊胚移植是目前輔助生殖過程中比較主流的方案[1]，因此囊胚的形成率及囊胚質(zhì)量對于治療成功影響重大。通常認(rèn)為，父源性基因在胚胎發(fā)育至6～8細(xì)胞期時(shí)才開始體現(xiàn)[2]，也就是說，囊胚發(fā)育過程伴隨著父源性基因的初步表達(dá)，囊胚的形成與精子DNA完整性之間可能有著密切的聯(lián)系。關(guān)于精子DFI與囊胚發(fā)育之間聯(lián)系的研究目前少見，本研究回顧性分析了精子DFI對囊胚發(fā)育的影響，以探討兩者之間的聯(lián)系。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2017年1～12月在本中心實(shí)施囊胚培養(yǎng)的579例促排卵周期，根據(jù)男方精液DFI檢測值分為兩組，DFI<20%為低DFI組，共470例；DFI≥20%為高DFI組，共109例。納入標(biāo)準(zhǔn)為女方盆腔輸卵管因素不孕，基礎(chǔ)FSH水平<10 mIU/ml，年齡<40歲，用于囊胚培養(yǎng)的卵裂胚數(shù)目≥3枚。本研究已經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核。

1.2研究方法

1.2.1精子DFI檢測 采用精液優(yōu)化處理與精子核完整性染色試劑盒（星博生物，中國）配合流式細(xì)胞儀進(jìn)行染色及檢測。

1.2.2囊胚培養(yǎng) 體外受精-胚胎移植（IVF-ET）周期進(jìn)行到D3時(shí)，對卵裂胚進(jìn)行移植或冷凍處理，將剩下的卵裂胚轉(zhuǎn)移到G-2 PLUS（Vitrolife，瑞典）培養(yǎng)基，置于6%二氧化碳、5%氧氣設(shè)置的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)到D5或者D6。

1.3觀察指標(biāo)

囊胚評分：桑椹胚內(nèi)出現(xiàn)囊腔即表示形成囊胚，根據(jù)Garnder囊胚分級法對形成的囊胚進(jìn)行評分。囊腔擴(kuò)張4級以上，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及外滋養(yǎng)層評級都在B以上的為優(yōu)質(zhì)囊胚；囊腔擴(kuò)張4級以上，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或外滋養(yǎng)層有一個(gè)評級為C的稱為可用囊胚；囊腔擴(kuò)張程度未達(dá)4級，或者內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和外滋養(yǎng)層都為C級的為不可用囊胚。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1一般情況

共納入囊胚培養(yǎng)周期579例，其中低DFI組470例，高DFI組109例。兩組的女方年齡、男方年齡、不育年限、基礎(chǔ)FSH及獲卵數(shù)之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

2.2兩組囊胚培養(yǎng)情況的比較

低DFI組的囊胚形成率為69.6%，高DFI組的囊胚形成率為63.8%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。低DFI組的可用囊胚率及優(yōu)質(zhì)囊胚率與高DFI組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

3討論

近年來，輔助生殖技術(shù)快速發(fā)展，除了女性因素，男性因素也越來越受到重視。受不育癥困擾的育齡夫婦中，存在男性因素的約占2/3[3]。目前臨床上主要依靠常規(guī)精液分析及精漿生化等檢查評估男性不育癥患者生育力，這些檢查能為男性不育癥患者生育力評估提供重要參考，然而受精液質(zhì)量波動的影響，精液分析檢查的結(jié)果也可能出現(xiàn)較大波動。另外，精液常規(guī)分析的結(jié)果還易受實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員的主觀影響。為了尋求其他反映精子質(zhì)量的指標(biāo)用來評估男性生育力、預(yù)測輔助生殖技術(shù)結(jié)局，波動小、準(zhǔn)確、客觀的精子染色質(zhì)完整性檢查逐漸受到重視，精子DNA損傷逐漸成為男性不育及輔助生殖領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[4-6]。

目前用于檢測精子DNA損傷的方法有精子染色質(zhì)擴(kuò)散試驗(yàn)（SCD）、吖啶橙試驗(yàn)（AOT）、末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）、精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析試驗(yàn)（SCSA）等，不同的檢測方法得到結(jié)果也并不一致。有研究顯示，在用AOT檢測精子DFI時(shí)，DFI檢測值的高低并不影響受精與卵裂[7]；而在使用彗星實(shí)驗(yàn)時(shí)，高DFI會對受精率、臨床妊娠率及著床率產(chǎn)生不利影響[8]；另外有研究認(rèn)為DFI的檢測方法中只有TUNEL法能預(yù)測IVF的臨床妊娠率[9]。造成這些差異的原因可能是由于檢測方法的不同、閾值選擇的不同、檢測精子的處理不同、納入研究的病例篩選不同、授精方式選擇的不同、精子DNA損傷的類型不同等。本研究通過雙層密度梯度離心法及上游法優(yōu)選精子，采用吖啶橙染色[10]配合流式細(xì)胞儀檢測精子DFI，根據(jù)以前相關(guān)研究將DFI閾值定為20%，并嚴(yán)格控制病例納入標(biāo)準(zhǔn)。

以往的動物實(shí)驗(yàn)顯示，受精及早期胚胎的發(fā)育會受到精子DNA完整性的影響。同樣，精子DNA完整性可以用來評估男性生育力，精子DFI與精子密度、活率、活力及正常形態(tài)精子百分率均成負(fù)相關(guān)[11-12]。然而精子DFI是否能用來預(yù)測胚胎發(fā)育及移植結(jié)局，是否有助于輔助生殖技術(shù)的選擇，目前尚無定論[13-15]。精子DFI的高低與正常受精、胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局似乎并沒有直接的聯(lián)系，這些研究通常只觀察到D3卵裂胚階段。有研究[16]證實(shí)精子DNA損傷會對胚胎質(zhì)量產(chǎn)生不良影響，但是該Meta分析納入的28項(xiàng)研究中涉及到囊胚階段的只有3項(xiàng)，其他都是D3以內(nèi)的卵裂胚發(fā)育情況。在本研究中，低DFI組有著更高的囊胚形成率，但對于可用囊胚率及優(yōu)質(zhì)囊胚率，兩組卻無明顯差別。人類胚胎的早期發(fā)育受母源基因調(diào)控，胚胎發(fā)育至6～8細(xì)胞期時(shí)才體現(xiàn)父源性基因，囊胚發(fā)育過程伴隨著父源性基因的初步表達(dá)。在高DFI組，精子DNA損傷比較嚴(yán)重，一旦父源性基因開始啟動，受精子DNA損傷誘導(dǎo)，胚胎出現(xiàn)凋亡或阻滯，發(fā)育至囊胚階段的比率就會降低。然而對于可用囊胚及優(yōu)質(zhì)囊胚，高DFI似乎并不會產(chǎn)生明顯的影響。筆者推測對于這些能發(fā)育至可用囊胚及優(yōu)質(zhì)囊胚的質(zhì)量較好的胚胎，可能存在較強(qiáng)的修復(fù)能力，精子高DFI帶來的不利影響似乎可以被消除。因此，在本研究中，精子高DFI能影響囊胚的數(shù)量，但是并不會對囊胚的質(zhì)量產(chǎn)生不良影響。

綜上所述，精子高DFI并不會對可用囊胚及優(yōu)質(zhì)囊胚的形成產(chǎn)生不利影響，但由于本研究病例有限，還需要更大規(guī)模的多中心臨床研究進(jìn)一步證實(shí)。另外還需對囊胚移植后的臨床結(jié)局及子代情況加以追蹤，從而明確對精子DNA損傷的研究在輔助生殖技術(shù)應(yīng)用中的價(jià)值。

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