王建美 高紅 徐巧娜

[摘要] 目的 研究閃式提取法提取蓮蓬中的原花青素的工藝條件。 方法 以蓮蓬中原花青素得率為評價(jià)指標(biāo)，單因素試驗(yàn)考察提取溶劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比等對蓮蓬中原花青素提取工藝的影響。以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間及空白為考察對象，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)。確定最佳提取工藝參數(shù)。 結(jié)果 最佳工藝條件為：乙醇的體積分?jǐn)?shù)為60%，提取時(shí)間為3 min，液料比40∶1。 結(jié)論 采用最佳工藝條件，蓮蓬原花青素得率為8.12%，與傳統(tǒng)提取法比較具有高效、省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 原花青素；蓮蓬；閃式提??；正交試驗(yàn)；紫外分光光度法

[中圖分類號] R284.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）09（a）-0025-04

[Abstract] Objective To research on extraction process of proanthocyanidins from seedpod of lotus with homogenate extraction method. Methods Taking the proanthocyanidins yield of seedpod of lotus as the evaluation index， single factor test was used to investigate the effect of volume fraction of solvent extraction， ethanol extraction time， extraction times and solid-liquid ratio on the extraction of procyanidins from seedpod of lotus. The orthogonal tests of four factors and three levels were carried out with ethanol volume fraction， material liquid ratio， extraction time and blank as the object of study. The optimum extraction process parameters were determined. Results The results showed that the optimum process conditions were as followed， the volume fraction of ethanol was 60%， the extraction time was 3 min， and the liquid material ratio was 40∶1. Conclusion With this condition， the proanthocyanidins yield of seedpod of lotus is 8.12%. Compared with the traditional extraction method， the flash method has the advantages of high efficiency and less time.

[Key words] Procyanidins； Seedpod of lotus； Homogenate extraction； Orthogonal test； Ultraviolet spectrophotometry

蓮蓬是睡蓮科蓮屬多年生水生草本植物蓮（Nelumbo nucifera Graertn.）的成熟花托，其作為蓮產(chǎn)品的副產(chǎn)物，資源十分豐富，但在蓮加工過程中常常被作為垃圾丟棄。有報(bào)道[1-6]，蓮蓬中含有較為豐富的原花青素。原花青素是國際上目前公認(rèn)最有效的清除人體內(nèi)自由基的天然抗氧化劑，其自由基清除能力和抗氧化功能是維生素E和維生素C的數(shù)十倍，能預(yù)防和治療八十多種因自由基引起的疾病，同時(shí)也能改善人體微循環(huán)[7-9]。此外，它還有抗炎、抗衰老、抗癌變、保護(hù)心血管、防止動脈硬化和調(diào)節(jié)免疫等功能[10-15]。由于原花青素強(qiáng)大的抗氧化活性，以及易溶于極性溶劑，再加上其顏色鮮艷亮麗等特點(diǎn)，符合人們回歸自然的需求，常被作為原料或添加劑應(yīng)用到日化用品、食品、保健品等領(lǐng)域。目前，原花青素的提取方法有水溶劑提取法、有機(jī)溶劑提取法、超聲提取法、微波提取法、超臨界提取法等[16-20]。各提取方法都存在一些優(yōu)缺點(diǎn)。酶解閃提法是在酶解提取的基礎(chǔ)上，應(yīng)用閃式提取器破碎植物組織，從而使有效成分從植物體中大量溶出的一種提取方法，具有快速、簡便、無需加熱等特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)選蓮蓬中原花青素的酶輔助閃式提取工藝，為蓮蓬中原花青素的工業(yè)提取法和蓮產(chǎn)業(yè)資源的綜合開發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

JHBE-50T閃式提取器（河南金鼎科技發(fā)展有限公司）；SB30001電子天平（上表電子儀器廠）；721型紫外可見分光光度計(jì)（上海奧析科學(xué)儀器有限公司）；EYELA SB-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；101型電熱恒溫干燥箱（中國龍口市先科儀器公司）。

1.2 試藥

蓮蓬：采摘于浙江省金華市武義縣，經(jīng)金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院藥學(xué)部中藥專業(yè)施淑琴副教授鑒定為睡蓮科蓮屬植物蓮的成熟花托；原花青素對照品（純度≥98%，Lot160619）：上海盛中醫(yī)藥化工有限公司；纖維素酶（50 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；香草醛（20140726）、甲醇（20161017）、乙醇（20151218）、濃鹽酸（20150412）均為分析純；水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品的制備

精密稱取原花青素對照品10.5 mg，置于10 mL容量瓶，用甲醇定容，搖勻，得1.05 mg/mL的原花青素對照品貯備液，備用。

2.2 供試品溶液的制備

采用閃式提取法[21]。將新鮮蓮蓬用干燥箱烘干，干品過40目篩，準(zhǔn)確稱取該干蓮蓬粉10 g，放入錐形瓶中，加入纖維素酶，酶量為2%，加適量水，50℃酶解1 h，放入提取罐中，按一定的料液比加入提取溶劑，稱量，閃式提取一定時(shí)間，用提取液補(bǔ)足減少的重量，過濾，得蓮蓬提取液，精密移取該品1 mL于100 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，得供試品溶液。

2.3 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密移取貯備液，配置成濃度為0.0525、0.105、0.1575、0.210、0.315、0.630 mg/mL的系列對照品溶液。精密移取上述對照品溶液和空白對照（甲醇溶液）各1 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%香草醛-甲醇溶液3 mL和濃鹽酸溶液1.5 mL，搖勻，在25℃條件下避光顯色30 min，取出，用空白對照調(diào)零，使用紫外可見分光光度計(jì)在500 nm處測定吸光度值（A）。以A為縱坐標(biāo)，以溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性回歸方程：A = -0.1300+3.653C，線性范圍為0.0525～0.315 mg/mL，r = 0.9997，線性關(guān)系良好。

2.4 供試品中原花青素濃度測定和蓮蓬原花青素得率計(jì)算

供試品溶液按“2.3”項(xiàng)方法測定吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算供試品溶液中的原花青素濃度。得率計(jì)算公式如下：得率=提取液中原花青素質(zhì)量/蓮蓬投料量×100%。

2.5 正交試驗(yàn)

由于提取過程中各因素的相互作用會引起得率的變化，而單因素試驗(yàn)不能反映各因素間的相互作用，因此，根據(jù)單因素試驗(yàn)，選取對閃式提取工藝有影響的主要因素（乙醇體積分?jǐn)?shù)A、提取時(shí)間B、料液比C），設(shè)計(jì)因素水平表，以蓮蓬中原花青素的得率為指標(biāo)，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)表優(yōu)化其閃式提取工藝。見表1。

2.6 各影響因素對蓮蓬中原花青素提取率的影響

2.6.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響 取處理好的蓮蓬各10 g，分別加入體積分?jǐn)?shù)為10%、20%、50%、60%、70%、80%、100%的乙醇溶液200 mL，采用提取電壓70 V，提取時(shí)間2 min，提取次數(shù)1次的條件下，按前述“2.2”實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算蓮蓬中原花青素得率，重復(fù)試驗(yàn)3次。結(jié)果顯示，蓮蓬中原花青素得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而提高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí)，得率最高；繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)，得率并未增加反而有所下降。故正交試驗(yàn)選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、60%和70%進(jìn)行考察。

2.6.2 提取時(shí)間的影響 取處理好的蓮蓬各10 g，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液200 mL進(jìn)行閃提，提取電壓70 V，提取次數(shù)1次，提取時(shí)間分別為0.5、1、2、3、4、5 min，得提取液樣品。再按前述“2.3”實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行吸光度測定，并計(jì)算蓮蓬中原花青素得率，重復(fù)試驗(yàn)3次。結(jié)果顯示，蓮蓬中原花青素得率隨著提取時(shí)間的增加而先提高后降低，在2 min和3 min時(shí)達(dá)到最高。隨著時(shí)間進(jìn)一步延長降低的原因可能是連續(xù)高速機(jī)械攪拌和剪切，使得提取液局部溫度升高，導(dǎo)致一部分原花青素被氧化破壞。因此，正交試驗(yàn)選取提取時(shí)間1、2、3 min進(jìn)行考察。

2.6.3 液料比的影響 取處理好的蓮蓬各10 g，按料液比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液進(jìn)行閃提，提取時(shí)間2 min，提取電壓70 V，提取次數(shù)1次，得提取液樣品。再按前述“2.3”實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行吸光度測定，并計(jì)算蓮蓬中原花青素得率，重復(fù)試驗(yàn)3次。結(jié)果顯示，蓮蓬中原花青素得率隨料液比增加而提高，但當(dāng)料液比達(dá)到20∶1時(shí)，得率趨向平行，也就是說料液比20∶1與70∶1未見顯著差異，故正交試驗(yàn)選取料液比20∶1、30∶1和40∶1進(jìn)行考察。

2.6.4 提取次數(shù)的影響 取處理好的蓮蓬各10 g，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液200 mL，以提取時(shí)間2 min，提取電壓70 V，提取次數(shù)分別為1、2、3、4次進(jìn)行提取，合并提取液得各提取液樣品。再按前述“2.3”實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行吸光度測定，并計(jì)算蓮蓬中原花青素得率，重復(fù)試驗(yàn)3次。結(jié)果顯示，蓮蓬中原花青素得率2次提取比1次有所增加，但再增加提取次數(shù)如3、4次時(shí)并未隨著提取次數(shù)的增加有顯著提高，幾乎呈直線狀，這可能與紫外分光光度法的測量誤差有關(guān)。但乙醇溶劑消耗成倍數(shù)增長，且濃縮純化耗時(shí)較多，故為了節(jié)約時(shí)間及能源，正交試驗(yàn)中提取次數(shù)統(tǒng)一為1次。

2.7 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)的表1進(jìn)行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析得各水平平均值（均值1、2、3）及各因素的極差，見表2。由表2可知，閃式提取工藝各因素對蓮蓬中原花青素得率影響的程度依次為A>B>C，即乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取時(shí)間>料液比，乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）對蓮蓬中原花青素得率影響最大，3個(gè)因素對蓮蓬中原花青素的閃式提取得率的最佳工藝條件為A2B3C3，即用60%體積分?jǐn)?shù)的乙醇，按40倍的液料比閃式提取3 min。對正交試驗(yàn)結(jié)果的3個(gè)因素進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。由表3可知，酶解閃式提取蓮蓬中原花青素的正交試驗(yàn)中，乙醇體積分?jǐn)?shù)對原花青素的提取率達(dá)到極顯著水平，另外提取時(shí)間和料液比2個(gè)因素的影響為顯著。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化所得的工藝組合（A2B3C3）進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其平均得率為8.12%。

3 討論

通過單因素實(shí)驗(yàn)選取適當(dāng)?shù)乃椒秶?，進(jìn)行酶輔助閃式提取蓮蓬原花青素的正交實(shí)驗(yàn)，以優(yōu)化提取工藝，獲得最優(yōu)工藝條件是：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，液料比40∶1，閃式提取時(shí)間3 min，其中各因素的影響順序是乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取時(shí)間>料液比。采用此工藝條件實(shí)驗(yàn)，蓮蓬原花青素的平均得率為8.12%。與周蕓[22]實(shí)驗(yàn)中采用傳統(tǒng)的單純水蒸氣蒸餾法提取的得率（5.89%～6.19%）和乙醇回流提取的得率（6.65%～7.26%）比較，在沒有降低原花青素提取得率的情況下，縮短了提取時(shí)間（回流提取法1次2 h，一般需提取2次），而閃式提取法只需要1～3 min，能提高提取效率。酶解閃式提取法提取蓮蓬中的原花青素可獲得較好效果。這是因?yàn)槊附忾W式提取法是在傳統(tǒng)溶劑法提取的基礎(chǔ)上，根據(jù)植物細(xì)胞壁的構(gòu)成，利用酶的反應(yīng)所具有的高度專一性特點(diǎn)，選擇相應(yīng)的酶，將細(xì)胞壁的組成成分降解或水解，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使構(gòu)成植物細(xì)胞壁等不易利用的植物纖維分解成葡萄糖，從而有利于有效成分從植物中溶出，本實(shí)驗(yàn)將再通過閃式提取技術(shù)，即依靠高速機(jī)械剪刀力和超動分子滲透，在常溫及溶劑存在下幾秒鐘內(nèi)把蓮蓬破碎至細(xì)微顆粒，使原花青素快速的被乙醇分子包圍、解離、替代，最后脫離蓮蓬進(jìn)入溶劑中，原花青素迅速達(dá)到組織內(nèi)外平衡，從而實(shí)現(xiàn)快速、高效、高得率的提取目的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為酶輔助閃式提取的大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用提供參考和依據(jù)。酶解閃式法需要專門的設(shè)備-閃式提取器，這是一種新型的提取設(shè)備，適用于中草藥葉、花、根、莖、果實(shí)等的提取，既可用于單味中藥提取，又可用于復(fù)方中藥提取，具有提取時(shí)間短、可避免有效成分受熱破壞的等優(yōu)點(diǎn)。但需注意的是，由于沒有類似儀器設(shè)備的操作經(jīng)驗(yàn)參考，使用時(shí)如操作不當(dāng)，不僅達(dá)不到預(yù)期的提取效果還可能損壞設(shè)備。

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（收稿日期：2017-11-24 本文編輯：張瑜杰）