楊憲魯　王海燕　湯華曉　叢濤　李玲芳

[摘要] 目的 研究結(jié)節(jié)性紅斑患者與健康對照人群外周血單核細胞中Toll樣受體9（TLR9）和核因子-κB（NF-κB）的表達情況，并分析其在結(jié)節(jié)性紅斑中的臨床意義。 方法 選擇2014年6月～2017年10月山東省威海市婦幼保健院及山東省威海市立醫(yī)院確診的結(jié)節(jié)性紅斑患者52例作為疾病組；另選健康體檢者41名作為對照組。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測外周血單核細胞中TLR9和NF-κB的mRNA水平。 結(jié)果 疾病組外周血中TLR9 mRNA水平較對照組明顯降低，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），疾病組NF-κB mRNA水平較對照組明顯升高，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。疾病組中TLR9與NF-κB的mRNA水平存在線性正相關(guān)關(guān)系（r = 0.89，P < 0.01）。 結(jié)論 與正常人群相比，結(jié)節(jié)性紅斑患者TLR9 mRNA水平明顯降低，NF-κB mRNA水平明顯升高，提示TLR9和NF-κB可能參與了結(jié)節(jié)性紅斑疾病的發(fā)病過程。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)節(jié)性紅斑；外周血；Toll樣受體9；核因子-κB

[中圖分類號] R275.986.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）09（b）-0106-03

[Abstract] Objective To study the expression of Toll-like receptor 9 （TLR9） and nuclear factor-κB （NF-κB） in peripheral blood mononuclear cell of erythema nodosum patients and healthy controls and to explore the clinical significance of TLR9 and NF-κB in erythema nodosum. Methods From June 2014 to October 2017， 52 patients with erythema nodosum from Weihai Women and Children′s Hospital and Weihai Municipal Hospital of Shandong Province were enrolled as disease group， and 41 healthy physical examinees served as control group. The mRNA levels of TLR9 and NF-κB in peripheral blood mononuclear cell were detected by real-time fluorescence quantitative PCR technique. Results The level of TLR9 in disease group was lower than that of control group， the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. The level of NF-κB in disease group was higher than that of control group， the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. In disease group， there was a positive linear correlation between TLR9 mRNA and NF-κB mRNA （r = 0.89， P < 0.01）. Conclusion Compared with normal people， the level of TLR9 mRNA in erythema nodosum patients is significantly decreased， while the level of NF-κB mRNA is significantly increased， suggesting that TLR9 and NF-κB may play an important role in the occurrence and development of erythema nodosum.

[Key words] Erythema nodosum； Peripheral blood； Toll-like receptor 9； Nuclear factor-κB

結(jié)節(jié)性紅斑（erythema nodosum，EN）是臨床常見的一種病因復(fù)雜并易反復(fù)發(fā)作的炎癥性皮膚病，病理表現(xiàn)為間隔性脂膜炎，主要臨床表現(xiàn)為雙小腿伸側(cè)疼痛性、對稱性紅色結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)為非潰瘍性，可自行消退，青年女性好發(fā)[1]。EN確切的發(fā)病機制目前尚不明確，其發(fā)生可能是機體對某些病原微生物抗原的一種遲發(fā)型超敏反應(yīng)，也可能是一種免疫復(fù)合物疾病[2]。人類Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類新的細胞表面信號傳導(dǎo)跨膜受體，是人體固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁，是一種機體通過感知微生物病原體直接作出防御反應(yīng)的天然免疫受體，TLR9是TLR家族的重要成員，能識別多種微生物的病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP），通過刺激信號的級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)和炎性細胞因子的產(chǎn)生，從而參與多種感染性疾病的進展[3]。核因子-κB（NF-κB）是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，主要是通過與啟動子及增強子的作用，從而促進多種免疫細胞及細胞因子的活化。TLR9和NF-κB是否參與了EN的發(fā)生發(fā)展，國內(nèi)外鮮見相關(guān)報道。本研究通過檢測EN患者外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中TLR9和NF-κB的表達，探討TLR9和NF-κB在EN發(fā)病機制中的可能作用，為深入開展EN免疫相關(guān)研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年6月～2017年10月山東省威海市婦幼保健院、山東省威海市立醫(yī)院皮膚科門診及住院患者52例為疾病組，其中男13例，女39例；年齡19～51歲，平均（29.4±5.8）歲；病程1 d～10年，平均（1.3±0.6）個月；輕型13例，中型34例，重型5例。另收集上述兩所醫(yī)院的健康體檢者41名為對照組，其中男17名，女24名，年齡20～52歲，平均（30.4±5.2）歲。兩組年齡、性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。

納入標準：所有患者均具有典型臨床表現(xiàn)，皮膚組織病理學(xué)檢查符合EN，診斷及分型符合文獻診斷分型標準[4]。排除標準：①1個月內(nèi)系統(tǒng)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、免疫調(diào)節(jié)劑或抗組胺藥物；②肝腎功能異常；③糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、心血管病、嚴重肝腎功能損傷性等系統(tǒng)疾??；④麻風(fēng)EN；⑤妊娠及哺乳期婦女。所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書，本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 分離PBMC 收集患者及健康體檢者靜脈血2～3 mL，肝素抗凝管保存，淋巴細胞分離液密度梯度離心法（2000 r/min，離心半徑15 cm，離心5 min）分離PBMC，放置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 測定PBMC中TLR9及NF-κB水平 將PBMC復(fù)融并平衡至室溫，加入1.5 mL RNAiso Plus（總RNA提取試劑，大連寶生生物公司，批號：16105）提取總RNA。用Real-time PCR（杭州博日科技有限公司，擴增儀型號：LineGene 9600 series）檢測TLR9及NF-κB mRNA表達量。按試劑盒（美國Thermo公司，DRR037A，批準文號：0020150918）說明，參照Genbank中目的基因mRNA序列設(shè)計相關(guān)引物（引物由上海生工生物工程有限公司合成），見表1，反應(yīng)條件為45℃預(yù)變性60 min，70℃變性5 s，4℃退火5 h，共運行45個循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以例表示，采用χ2檢驗，相關(guān)性分析應(yīng)用Pearson分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血TLR9和NF-κB的mRNA水平比較

疾病組TLR9 mRNA水平明顯低于對照組，NF-κB mRNA水平明顯高于對照組，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見表2。

2.2 兩組中TLR9與NF-κB相關(guān)性分析

疾病組中TLR9與NF-κB存在線性正相關(guān)關(guān)系（r = 0.89，P < 0.01）。

3 討論

EN是一種以雙下肢疼痛性紅斑為主要臨床特征的炎癥性皮膚病[5]，其病因復(fù)雜，主要包括感染、特發(fā)性、藥物、自身免疫性疾病、腫瘤、妊娠等[6]。目前主要診斷依據(jù)是臨床表現(xiàn)和組織病理學(xué)診斷，其中組織病理學(xué)的主要表現(xiàn)為間隔性脂膜炎。EN發(fā)病機制多樣，可為一種獨立的皮膚病，也可為其他疾病的皮膚表現(xiàn)，臨床上需要根據(jù)臨床表現(xiàn)、病史和實驗室檢查進行綜合診斷[7]。張琛等[8]認為病原微生物感染人體誘導(dǎo)疾病發(fā)生，從而引起機體免疫功能紊亂是發(fā)病的主要原因，其中免疫機制在EN發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。譚自明等[9]對27例EN患兒的病因及免疫特點進行分析，發(fā)現(xiàn)細胞免疫紊亂可能在EN發(fā)病過程中起到重要作用。陳麗莉等[10]通過研究EN患者皮損處CD4、CD8表達情況，發(fā)現(xiàn)疾病組CD4陽性表達率明顯高于正常組，CD8陽性表達率與正常組相比無統(tǒng)計學(xué)差異，說明CD4+T細胞在EN皮損的發(fā)病過程中起重要作用，從而提示EN患者皮損處存在著T淋巴細胞亞群的失衡。

研究表明，TLRs在機體感染防御中起重要作用，是機體抵抗感染的第一道屏障[11-12]。TLRs能夠識別自身RNA和DNA而引起自身免疫性疾病[13]，如血管炎中可通過活化和調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答促進疾病的發(fā)生發(fā)展[14]。韓晨珠等[15]發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)性紅斑患者皮損處人類白細胞DR抗原（human leukocyte antigen DR，HLA-DR）分子高表達，間接證實T淋巴細胞介導(dǎo)的細胞免疫反應(yīng)在EN的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。作為TLR家族成員之一，TLR9表達于免疫細胞，在PBMC中，主要表達TLR9的細胞是漿細胞來源的樹突狀細胞和B細胞[16]，通過與細菌DNA作用而誘導(dǎo)機體的固有免疫反應(yīng)。研究表明TLR9參與感染過程，主要是通過識別細菌或病毒上未甲基化的CpG序列完成[17]。TLR9活化的信號傳導(dǎo)屬于典型的Toll樣受體信號通路，可以啟動經(jīng)典的NF-κB途徑，產(chǎn)生大量炎性細胞因子，幫助機體抵御感染等致病因素[18]。TLR9能夠直接參與抵抗病原微生物的侵襲，同時也可以通過釋放特異的炎癥介質(zhì)和啟動相應(yīng)免疫細胞，從而在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[19]。也有研究發(fā)現(xiàn)，激活TLR9可誘導(dǎo)人B淋巴細胞表面活化因子（B-cell activating factor，BAFF）的表達，進一步促進BAFF的增殖，從而推測激活人B淋巴細胞表面的TLR9在自身免疫性疾病發(fā)病機制中發(fā)揮了重要的作用[20]。

目前對于TLR在EN患者中的表達及相關(guān)性報道很少，由于TLR9、NF-κB在感染和疾病免疫中的重要作用，深入研究TLR9、NF-κB在EN患者外周血中的表達，有助于EN發(fā)病機制的進一步明確。本研究通過對EN患者與健康人群進行對比研究，發(fā)現(xiàn)疾病組TLR9 mRNA水平較對照組明顯降低（P < 0.01），疾病組NF-κB mRNA水平較對照組明顯升高（P < 0.01），提示EN疾病的發(fā)生可能與TLR介導(dǎo)的相關(guān)信號傳導(dǎo)產(chǎn)生炎性因子有關(guān)，其可能的機制為當(dāng)TLR9被細菌或病毒等配體激活后，經(jīng)多步反應(yīng)，導(dǎo)致NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)核，共同參與固有免疫應(yīng)答，對了解EN患者PBMC中TLR9和NF-κB的表達率和定量表達水平的差異有重要意義，同時能進一步證實本病的發(fā)生與感染的密切關(guān)系。本研究還發(fā)現(xiàn)疾病組PBMC中TLR9和NF-κB的mRNA水平具有線性正相關(guān)關(guān)系，因此我們推測在EN發(fā)病過程中，內(nèi)源性或外源性因素使得機體免疫上游的TLR9、NF-κB被激活，引起炎癥介質(zhì)，包括細胞因子、自由基等的釋放，引起補體級聯(lián)反應(yīng)，打破機體的免疫耐受，導(dǎo)致EN的發(fā)病。

綜上所述，TLRs在EN患者發(fā)病過程中具有極其重要的作用，TLR9、NF-κB可能是EN發(fā)病的重要免疫調(diào)控因素之一，也可能對EN患者感染的發(fā)生和控制有著重要的介導(dǎo)作用，嚴密監(jiān)測EN患者外周血中TLR9及NF-κB的mRNA水平變化，對本病的診療具有重要的診斷價值，從而為EN患者疾病的預(yù)防與感染的控制開辟新的思路。本研究樣本量較少，可能造成實驗結(jié)果的局限性，后續(xù)仍需進行大樣本量的實驗進一步證實。

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（收稿日期：2018-04-02 本文編輯：張瑜杰）