秦海霞，尚翠玲，李少平，朱利紅，張全華，王世進(jìn)

宮頸癌是發(fā)病率僅次于乳腺癌的常見(jiàn)女性惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性生命安全[1]。順鉑是宮頸癌一線化療藥物基石，但由于先天性或獲得性耐藥，使得部分患者無(wú)法獲益[2]。組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 6,HDAC6)是重要的Ⅱ型組蛋白去乙?；讣易宄蓡T，其通過(guò)促多種基因乙?；_(dá)到促腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的作用[3]。研究表明，HDAC6在宮頸癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與宮頸癌臨床分期、浸潤(rùn)程度及淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示HDAC6參與宮頸癌發(fā)生發(fā)展，并且發(fā)揮類似促癌基因的作用[4-5]。抑制HDAC6表達(dá)是否可起到抗宮頸癌作用，其對(duì)宮頸癌順鉑敏感性的影響又如何均尚未可知。本研究擬利用小分子干擾RNA(small interference RNA,siRNA)技術(shù)降低宮頸癌Hela細(xì)胞中HDAC6表達(dá)，并觀察HDAC6表達(dá)變化對(duì)宮頸癌順鉑敏感性的影響，以期為宮頸癌分子靶向治療提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料人宮頸癌細(xì)胞系Hela購(gòu)于美國(guó)ATCC；DMEM培養(yǎng)基、PBS、胰酶、胎牛血清購(gòu)于Gibco公司；MTT試劑盒購(gòu)于博士德生物有限公司；RNA提取試劑盒購(gòu)于博士德生物有限公司；Lipofectamine TM 2000脂質(zhì)體購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；HDAC6單克隆抗體、Bcl-2單克隆抗體、Bax單克隆抗體、β-actin單克隆抗體購(gòu)于大連Takara公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于BD公司；HDAC6 siRNA、Control siRNA由廣州銳博科技有限公司構(gòu)建。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染復(fù)蘇Hela細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)液(1%雙抗+10%FBS)懸浮細(xì)胞，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞并接種于6孔培養(yǎng)板中，然后繼續(xù)置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待貼壁細(xì)胞長(zhǎng)滿底部面積的40%～50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞隨機(jī)分為3組，每組3孔，即空白對(duì)照組、Control siRNA組和HDAC6 siRNA組?？瞻讓?duì)照組加入PBS；Control siRNA組和HDAC6 siRNA組分別轉(zhuǎn)染Control siRNA和HDAC6 siRNA，轉(zhuǎn)染操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染結(jié)束后繼續(xù)恒溫培養(yǎng)6 h，更換培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞；轉(zhuǎn)染后48 h，收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3RT-PCR法檢測(cè)HDAC6表達(dá)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，與順鉑藥物作用48 h后，收集100 μg·μL-1順鉑處理后的細(xì)胞，采用Trizol試劑盒分別提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄總RNA至cDNA，之后取1 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物行RT-PCR(SYBR Green法)，以β-actin為內(nèi)參。HDAC6上游引物序列：5’-AGGTAAAGG-GGAAGAAACAAA-3’；HDAC6下游引物序列：5’-TGCGGATGAGTTGTTTCTGGC-3’。β-actin上游引物序列：5’-CATGTCGAGTTAAGGAGAAGC-3’；β-actin下游引物序列：5’-CTTTTAGTGGAGTGCCACAGG-3’。采用2-ΔΔCt分析法對(duì)熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行分析，在獲得每個(gè)樣品的Ct值之后求其平均值，隨后再減去各自的內(nèi)參平均Ct值，以此得到ΔCt。比較兩個(gè)樣本間的ΔCt值相減得到ΔΔCt值，隨后求得2-ΔΔCt以得到相對(duì)基因表達(dá)差異的倍數(shù)。

1.4Westernblot法檢測(cè)HDAC6蛋白表達(dá)收集轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞并提取細(xì)胞蛋白，定量蛋白濃度后行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，將膜置于5%封閉液4 ℃封閉4 h，PBS洗滌3次，分別加入HDAC6單克隆抗體(1∶2 000)孵育過(guò)夜，PBS洗滌3次，二抗(1∶500)孵育4 h，PBS洗滌3次，按ECL試劑盒說(shuō)明書(shū)行電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，加入順鉑至終濃度100 μg·μL-1，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，PBS洗滌2次，加入500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，依次加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL磺化丙啶，室溫避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.6MTT法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)24 h，分別加入順鉑至終濃度為0、12.5、25、50、100、200 μg·μL-1，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后離心棄上清每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液(每孔20 μL)，繼續(xù)37 ℃、5%CO2恒溫繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清，加入100 μL DMSO，振蕩至結(jié)晶物充分溶液，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)450 nm處OD值。細(xì)胞抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。計(jì)算各組細(xì)胞對(duì)順鉑的50%抑制濃度(inhibitory concentration, IC50)。

1.7順鉑誘導(dǎo)的凋亡基因表達(dá)收集轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，加入順鉑至終濃度100 μg·μL-1，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，提取細(xì)胞蛋白。蛋白濃度定量后SDS-PAGE凝膠電泳轉(zhuǎn)膜，將膜置于5%封閉液4 ℃封閉4 h，PBS洗滌3次，分別加入Bcl-2、Bax單克隆抗體(1∶2 000)孵育過(guò)夜，PBS洗滌3次，二抗(1∶500)孵育4 h，PBS洗滌3次，按ECL試劑盒說(shuō)明書(shū)行電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的條帶灰度值/同一樣本內(nèi)參灰度值。

2 結(jié)果

2.1RT-PCR檢測(cè)HDAC6mRNA表達(dá)HDAC6 siRNA組HDAC6 mRNA表達(dá)(82.3±24.5)顯著低于空白對(duì)照組(352.7±89.2)及Control siRNA組(361.7±77.6)(均P<0.05)，見(jiàn)圖1。

A:空白對(duì)照組；B:control siRNA組；C:HDAC6 siRNA組。①與A組比較，P<0.05；②與B組比較，P<0.05。圖1 RT-PCR法檢測(cè)HDAC6 mRNA表達(dá)

2.2各組HDAC6蛋白表達(dá)HDAC6 siRNA組HDAC6 蛋白表達(dá)(118.7±20.9)顯著低于空白對(duì)照組(558.4±105.5)及Control siRNA組(564.9±98.5)(均P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.3HDAC6siRNA對(duì)凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，HDAC6 siRNA組細(xì)胞凋亡率(37.6±8.7)%，顯著高于空白對(duì)照組的(5.8±1.1)%及Control siRNA組的(6.4±1.3)%，見(jiàn)圖3。

2.4HDAC6siRNA的順鉑敏感性不同濃度順鉑作用48 h后，HDAC6 siRNA組細(xì)胞存活率顯著低于空白對(duì)照組及Control siRNA組(均P<0.05)，見(jiàn)圖4。

A:空白對(duì)照組；B:control siRNA組；C:HDAC6 siRNA組。①與A組比較，P<0.05；②與B組比較，P<0.05。圖2 HDAC6 蛋白表達(dá)

A:空白對(duì)照組；B:control siRNA組；C:HDAC6 siRNA組。①與A組比較，P<0.05；②與B組比較，P<0.05。圖3 各組細(xì)胞凋亡率比較

圖4 各組細(xì)胞存活率比較

2.5HDAC6siRNA對(duì)凋亡基因表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，HDAC6 siRNA組Bcl-2 蛋白表達(dá)(179.5±44.6)顯著低于空白對(duì)照組(494.1±65.3)及Control siRNA組(487.2±74.1)(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)(448.6±70.8)顯著高于空白對(duì)照組(189.7±60.3)及Control siRNA組(194.2±68.4)(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

A:空白對(duì)照組；B:control siRNA組；C:HDAC6 siRNA組。①與A組比較，P<0.05；②與B組比較，P<0.05。圖5 Western blot法檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

3 討論

宮頸癌起病隱匿，大多數(shù)患者確診時(shí)已為中晚期，即使采用含鉑類藥物化療，患者臨床受益率和癥狀緩解率也不盡人意，其原因與鉑類藥物原發(fā)性及繼發(fā)性耐藥有關(guān)[6-7]。因此，探討宮頸癌鉑類耐藥機(jī)制是提高宮頸癌化療敏感性和改善臨床預(yù)后的關(guān)鍵。

組蛋白的乙?；腿ヒ阴；菒盒阅[瘤發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)。HDCA6屬于微管蛋白去乙?；?，定位于人染色體Xp11.23上，由1個(gè)鋅指基序和2個(gè)功能性去乙?；Y(jié)構(gòu)組成，其可通過(guò)依賴性和非依賴性去乙?；氛{(diào)控微管蛋白聚集，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的趨化性運(yùn)動(dòng)，從而參與腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[8-10]。Wang等研究顯示，抑制HDAC6表達(dá)可促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞DNA損傷及細(xì)胞凋亡，提示HDAC6表達(dá)水平高低可能是影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性的重要因素[11]。本組前期研究發(fā)現(xiàn)，利用siRNA技術(shù)沉默宮頸癌Hela細(xì)胞中HDCA6表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞增殖，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與調(diào)控細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白p21及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)有關(guān)，提示HDCA6參與宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展，但其對(duì)宮頸癌順鉑敏感性的調(diào)控作用尚未可知。本研究結(jié)果顯示，HDCA6 siRNA組宮頸癌Hela細(xì)胞中HDCA6 mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組及Control siRNA組(均P<0.05)，同時(shí)HDCA6 siRNA組IC50值顯著低于空白對(duì)照組及Control siRNA組(均P<0.05)，提示利用siRNA技術(shù)沉默宮頸癌Hela細(xì)胞中HDCA6表達(dá)可提高宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。

如前所述，HDCA6可調(diào)控細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白p21表達(dá)，而后者可通過(guò)抑制cyclin/cdk2活性負(fù)向調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，其表達(dá)缺失已被證實(shí)與腫瘤細(xì)胞化療耐藥有關(guān)。故推測(cè)，沉默HDCA6表達(dá)可上調(diào)細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白p21表達(dá)，從而減少宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性[12]。此外，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，HDCA6 siRNA組Hela細(xì)胞凋亡率顯著高于空白對(duì)照組及Control siRNA組(均P<0.05)，提示利用siRNA技術(shù)沉默宮頸癌Hela細(xì)胞中HDCA6表達(dá)可促細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步分析凋亡基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)，HDAC6 siRNA組Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組及Control siRNA組(均P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組及Control siRNA組(均P<0.05)。Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中的抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白，Bcl-2/Bax比值是決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡狀態(tài)的關(guān)鍵因素。當(dāng)Bcl-2/Bax平衡傾向Bax亢進(jìn)時(shí)，Bax同源二聚體迅速形成，易于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13-14]。本研究結(jié)果提示，鑒于Bcl-2/Bax在細(xì)胞凋亡中的核心調(diào)控地位，故推測(cè)HDAC6可通過(guò)調(diào)控Bcl-2/Bax表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這可能也是沉默HDAC6表達(dá)后宮頸癌細(xì)胞順鉑敏感性提高的主要分子作用機(jī)制。

綜上所述，利用siRNA技術(shù)沉默HDAC6表達(dá)可提高宮頸癌Hela細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，而促進(jìn)細(xì)胞凋亡可能是其主要作用機(jī)制。