劉 波，劉文強，左中夫，2

糖尿病認知功能障礙(diabetic cognitive dysfunction, DCD)是由糖尿病糖代謝紊亂所導致[1]，表現(xiàn)為記憶力減退、學習能力下降，語言能力、理解力、定向力等能力均受到不同程度的影響[2]。目前尚缺乏特效的治療措施，現(xiàn)代醫(yī)學治療以降血糖、減輕胰島素抵抗和營養(yǎng)腦神經(jīng)等綜合治療為主[3]。腦苷肌肽為國際上公認的，可從根本上修復受損神經(jīng)，促進細胞再生，恢復神經(jīng)生理功能的特效藥[4]，與腦細胞生長發(fā)育、學習記憶等功能關系密切[5-7]，有望應用于糖尿病認知功能障礙的治療。本研究以健康成年SD大鼠為研究對象，通過建立糖尿病大鼠模型，觀察腦苷肌肽治療后，糖尿病大鼠空間記憶能力的行為學改變，收集血清及海馬組織分析導致這種改變的具體機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1實驗分組選取健康SD成年大鼠40只，雄性，5月齡，體質量180～200 g。大鼠1籠5只，自由飲水進食。將大鼠隨機分為5組：腦苷肌肽低劑量組(0.2 mL·kg-1)、腦苷肌肽中劑量組(0.6 mL·kg-1)、腦苷肌肽高劑量組(1.8 mL·kg-1)、糖尿病模型組和空白對照組，每組10只。

1.2緩沖液配置取2.101 g檸檬酸與2.941 g檸檬酸鈉各溶于100 mL蒸餾水中，分別配置成0.1 mmol·L-1溶液，再按照1∶1.32比例將檸檬酸溶液于檸檬酸鈉溶液混合，配置成0.1 mmol·L-1，pH4.5的緩沖液。

1.3糖尿病大鼠模型建立采用鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)一次性大量腹腔注射，建立大鼠糖尿病模型。所有大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后，禁食12 h。腦苷肌肽干預組、糖尿病模型組以60 mg·kg-1腹腔一次性注射STZ。對照組注射等量枸櫞酸鈉緩沖液。所有大鼠均在同一動物房內分籠飼養(yǎng)，給予標準飲食。連續(xù)喂養(yǎng)2周后，測定血糖、尿糖及尿量，血糖≥16.7 mmol·L-1為建模成功。

1.4糖尿病大鼠空間記憶能力的行為學觀察造模12周后用Morris水迷宮及Y迷宮測試大鼠。Morris水迷宮及Y迷宮適應性訓練，每日1次，每次120 s，適應性訓練3 d后正式進行Morris水迷宮及Y迷宮測試。①Morris水迷宮試驗：試驗前將大鼠置于站臺上適應10 s，再將大鼠隨機從不同象限面壁置入池內，大鼠登上站臺5 s后終止記錄，最長記錄時間120 s，大鼠在120 s內無法上臺，引導大鼠登上站臺適應10 s，再將大鼠擦干放入鼠籠。每日訓練4次，每次間隔1 h。測量平臺象限游泳時間、平臺象限游泳路程占總路程百分比、第1環(huán)點數(shù)、總得分。訓練3 d后，在第4、5天進行實驗測試，測試時間為每只120 s。②Y迷宮試驗：將大鼠放入迷宮，適應5 min，再將大鼠放入某一臂作為起步區(qū)進行電擊，觸電后10 s內一次性跑向安全區(qū)為正確反應，每次測試間隔30 s，依次重復至大鼠學會為止。學會標準為連續(xù)10次電擊有9次正確反應，否則為未學會。第2天進行正式測試，每只大鼠測試30次，記錄自發(fā)性探索行為正確率、各臂次數(shù)總和及自發(fā)變換行為百分比。小鼠后肢完全進入臂內未完成1次進入，連續(xù)進入3個不同的臂通號，為完成1次自發(fā)變換行為。

1.5血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶與S-100B蛋白的表達 分別于治療前、治療2周后，取空腹靜脈血3 mL，3 000 r·min-1離心10 min 收集血清，-70 ℃冷凍保存，檢測血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)與S-100B蛋白的表達。采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測，嚴格按照試劑盒(美國BPB Biomedicals)操作說明進行操作。

1.6胰島素樣生長因子的表達采用ELISA法檢測胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor,IGF) IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR。按ELISA試劑盒(上海紀寧)操作，4 ℃保存，鏡下拍照判讀結果。每只大鼠取有海馬CA3區(qū)的5張不同斷面切片進行免疫組化染色，光鏡下隨機選取5個高倍鏡視野，計數(shù)陽性細胞占總細胞比例，觀察染色強度，以ImagePro軟件進行圖像分析。以棕黃色染色細胞數(shù)比例大于30%、染色強度為陽性，判讀為陽性。

1.7統(tǒng)計學分析采用SAS 9.0統(tǒng)計軟件分析試驗數(shù)據(jù)，多組間計量資料比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。多組間計數(shù)資料比較采用卡方檢驗。檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1Morris迷宮糖尿病大鼠空間記憶能力測試結果，糖尿病模型組平臺象限游泳時間、平臺象限游泳路程占總路程百分比、第1環(huán)點數(shù)、總得分均顯著低于正常對照組。經(jīng)腦苷肌肽治療后，平臺象限游泳時間、平臺象限游泳路程占總路程百分比、第1環(huán)點數(shù)、總得分與糖尿病模型組相比，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。隨著腦苷肌肽劑量的升高，上述指標逐漸升高(均P<0.05)，見表1。

表1 Morris迷宮糖尿病大鼠空間記憶能力測試

注：①與模型組相比，P<0.05；②與對照組相比，P<0.05。

2.2Y迷宮糖尿病大鼠空間記憶能力測試結果糖尿病模型組自發(fā)性探索行為正確率、行為變換百分比、各臂次數(shù)總和顯著低于正常對照組。經(jīng)腦苷肌肽治療后，自發(fā)性探索行為正確率、各臂次數(shù)總和顯著高于糖尿病模型組，隨著腦苷肌肽劑量的升高，上述指標逐漸升高(均P<0.05)。各組行為變換百分比差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表2。

表2 Y迷宮糖尿病大鼠空間記憶能力測試

注：①與模型組相比，P<0.05。②與對照組相比，P<0.05。

2.3血清NSE與S-100B蛋白表達情況糖尿病模型組血清NSE、S-100B水平顯著高于正常對照組。經(jīng)腦苷肌肽治療后，血清NSE、S-100B水平顯著低于糖尿病模型組，隨著腦苷肌肽劑量的升高，上述指標逐漸下降(均P<0.05)，見表3。

表3 血清NSE、S-100B表達情況 μg·L-1

注：①與模型組相比，P<0.05；②與對照組相比，P<0.05。NSE:神經(jīng)元特異性烯醇化酶。

2.4免疫組化檢測IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR表達糖尿病模型組中IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR陽性表達率顯著低于對照組。經(jīng)腦苷肌肽治療后，腦苷肌肽高劑量組IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR陽性表達率顯著高于糖尿病模型組(均P<0.05)，見表4。

表4 各組IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR表達情況例(%)

注：①與模型組相比，P<0.05；②與對照組相比，P<0.05。

3 討論

近年來，隨著我國人民生活水平提高，飲食結構改變，糖尿病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，其中大多數(shù)為2型糖尿病[8]。長期高血糖狀態(tài)，可對中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能造成不良影響，以認知功能障礙最為常見。認知功能即機體認識、獲取并加工信息的心理過程，為大腦處理高級活動的能力，包括學習、語言、注意、記憶、計算、定向和執(zhí)行力等[9-10]。臨床報道顯示，2型糖尿病患者認知功能損害程度較正常人高2倍以上[11]。2型糖尿病患者持續(xù)高血糖狀態(tài)可導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷而影響大腦認知功能，可使患者出現(xiàn)癡呆、生活自理能力下降、糖尿病自我監(jiān)測能力和生活質量下降等[12]。由此可見，隨著老齡化及糖尿病患者增多，糖尿病認知功能障礙愈發(fā)不可忽視。

腦苷肌肽為多肽、多種神經(jīng)節(jié)苷脂的復合制劑，小分子多肽為神經(jīng)細胞的基本物質之一，也是神經(jīng)系統(tǒng)的營養(yǎng)物質，與腦細胞生長發(fā)育與學習記憶等功能關系密切[13]。神經(jīng)節(jié)苷脂存在于哺乳動物中樞神經(jīng)，尤其是神經(jīng)元細胞的細胞膜中，可促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育及腦功能恢復[14]。臨床報道顯示腦苷肌肽可通過多種途徑發(fā)揮治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的功能，包括：①通過激活神經(jīng)生長因子，提供充足營養(yǎng)及能力，促進軸突生長、突觸形成，提高神經(jīng)細胞的存活率，促進神經(jīng)再生。②顯著減少損失后大腦半球的缺血梗死灶，提高血紅蛋白的載氧能力，改善腦組織缺血、缺氧，改善腦能量代謝。③可透過血腦屏障進入神經(jīng)細胞膜，激活、保護細胞膜離子泵系統(tǒng)，糾正離子紊亂，防止神經(jīng)細胞內鈣離子積聚，恢復調制神經(jīng)系統(tǒng)正常電生理功能。糖尿病認知障礙患者由于存在明顯的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，應用腦苷肌肽恢復受損的神經(jīng)細胞，理論上具有可行性。

為探討腦苷肌肽治療糖尿病認知功能障礙的具體機制，本研究通過行為學觀察初步證實腦苷肌肽可用于糖尿病認知障礙的臨床治療中。研究結果顯示，Morris迷宮提示糖尿病模型組平臺象限游泳時間、平臺象限游泳路程占總路程百分比、第1環(huán)點數(shù)、總得分均顯著低于正常對照組。提示糖尿病模型組普遍存在空間記憶能力下降。經(jīng)腦苷肌肽治療后，平臺象限游泳時間、平臺象限游泳路程占總路程百分比、第1環(huán)點數(shù)、總得分顯著提高。隨著腦苷肌肽劑量的升高，上述指標逐漸升高。說明腦苷肌肽具有改善大鼠空間記憶能力的作用，且隨著藥物使用劑量的增加，改善效果也逐漸增強。Y迷宮的結果與Morris迷宮結果類似，糖尿病模型組自發(fā)選擇性行為的空間記憶能力較對照組顯著下降，經(jīng)腦苷肌肽治療后，空間記憶能力顯著提高，且與劑量呈正相關，表現(xiàn)為自發(fā)選擇性探索行為正確率、行為變換百分比、各臂次數(shù)總和顯著提高。

進一步證實腦苷肌肽改善糖尿病大鼠空間記憶能力的具體機制，本研究分別取大鼠血清及海馬CA3區(qū)組織為研究對象，觀察血清中NSE、S-100B水平及IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR表達情況。其中NSE和S-100B是臨床常用神經(jīng)特異性標志物，其中NSE定位于神經(jīng)元及神經(jīng)內分泌細胞中，為糖酵解中的關鍵酶，正常情況下血清中含量很低，神經(jīng)膠質細胞及其他腦神經(jīng)組織中不含NSE[15]。神經(jīng)元壞死，NSE可漏至細胞外間隙，使體液中含量增加。血液及腦脊液中NSE濃度變化與腦損傷呈正相關，可反映神經(jīng)元損傷的嚴重程度及梗死灶大小，也是預后的預測指標之一。S-100B為酸性鈣結合蛋白，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)膠質細胞與雪旺式細胞，水平變化可反映腦膠質細胞損傷的嚴重程度。有研究發(fā)現(xiàn)S-100B濃度升高的患者都存在不同程度的認知功能障礙[16]。二者聯(lián)合檢測，可以比較準確地反映早期腦組織的損害情況。糖尿病模型組血清NSE、S-100B水平顯著高于正常對照組，說明糖尿病大鼠中存在明顯的認知功能障礙，經(jīng)治療后血清NSE、S-100B水平顯著下降，說明腦苷肌肽可通過降低血清NSE、S-100B水平來發(fā)揮改善認知功能障礙的作用。

臨床報道顯示[17]，海馬為神經(jīng)中樞記憶回路的重要結構，與認知功能存在密切關系。研究表明[18]海馬對高血糖較敏感，2型糖尿病患者在慢性高血糖刺激下，海馬神經(jīng)元數(shù)量減少、形態(tài)異?；蚬δ苁д{，可導致相關的學習、認知功能障礙。海馬區(qū)與認知功能障礙與胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、胰島素樣生長因子-Ⅰ受體(IGF-ⅠR)密切相關。IGF-Ⅰ為具有多種生理功能的活性多肽[19]，可抑制神經(jīng)元凋亡，調節(jié)乙酞膽堿的合成、釋放，抑制蛋白的過度磷酸化[20]。IGF-ⅠR為細胞膜表面的糖蛋白，在認知功能障礙患者的額葉皮質、海馬和下丘腦部位，IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR表達顯著減少[21]?；诖?，本研究選擇海馬CA3區(qū)組織行免疫組織化學檢測IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR表達情況，結果顯示，糖尿病模型組中IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR陽性表達率顯著低于對照組。經(jīng)腦苷肌肽治療后，IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR陽性表達率顯著升高，且隨著腦苷肌肽劑量升高，IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR陽性表達率也顯著升高。說明腦苷肌肽可通過激活IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR表達，發(fā)揮治療糖尿病大鼠認知功能障礙的作用。

綜上所述，腦苷肌肽可顯著改善糖尿病大鼠空間記憶能力，機制可能與降低血清NSE、S-100B水平，提高海馬中IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR蛋白水平有關。