胡忠昌，曹 陽(yáng)，吳 健，金海國(guó)，趙玉民*

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧科學(xué)分院，吉林公主嶺 136100；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延邊 133002）

延黃牛是我國(guó)經(jīng)過(guò)27年選育而成的優(yōu)秀肉牛品種，具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)肉率高等優(yōu)點(diǎn)，是具有鮮明地域特點(diǎn)和朝鮮族特色的高檔肉牛品種[1-2]。

乙醛脫氫酶1A1（Acetaldehyde Dehydrogenase 1A1，ALDH1A1）為乙醛脫氫酶（ALDHs）基因超家族成員之一，該基因位于人的第19號(hào)染色體的長(zhǎng)臂21區(qū)31亞區(qū)，主要存在于肝臟[3]、晶狀體[4]、腦組織、視網(wǎng)膜[5]和胃腸道黏膜上[6]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，ALDH1A1基因的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為54.86 ku，推測(cè)總原子數(shù)目達(dá)到7 700個(gè)，而半衰期可達(dá)到30 h，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，是親水性蛋白質(zhì)，其不穩(wěn)定系數(shù)小于30，平均疏水性值約為-0.16[7-8]。在動(dòng)物肝臟中ALDHs能將醇類化合物氧化成對(duì)應(yīng)的醛類[9]。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，ALDH1A1基因可以通過(guò)調(diào)控視黃醛信號(hào)通路的升高而促進(jìn)葡萄糖和脂質(zhì)的氧化。Park等[11]在小鼠中研究發(fā)現(xiàn)沉默ALDH1A1基因能使視黃醛毒性在癌癥細(xì)胞中減少。ALDH1A1基因在脂肪細(xì)胞分泌調(diào)節(jié)中也發(fā)揮重要作用，能夠通過(guò)交感神經(jīng)元促進(jìn)白色脂肪組織的生長(zhǎng)和神經(jīng)支配，且顯著刺激體內(nèi)和體外軸突神經(jīng)的生長(zhǎng)[12-13]。目前，關(guān)于ALDH1A1基因的研究還局限于人類癌癥方面，而作為重要的脂肪酸代謝調(diào)控基因，在尋找可行性遺傳標(biāo)記SNP位點(diǎn)方面至今還未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本研究以16月齡延黃牛母牛為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用Sanger直接測(cè)序的方法檢測(cè)ALDH1A1基因多態(tài)性，分析其與延黃牛體尺、肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性，為開(kāi)展延黃牛肉質(zhì)候選基因篩選的工作提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 隨機(jī)抽取16月齡的99頭延黃牛母牛（吉林省琿春市吉興牧業(yè)有限公司提供），采集延黃牛耳組織約1.5 g，放入含有75 %乙醇的2 mL離心管中，標(biāo)記好牛號(hào)和時(shí)間帶回實(shí)驗(yàn)室提取DNA。

1.2 主要試劑及儀器 AxyPrep基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自Axygeno公司，2XES Taq MasterMix購(gòu)自CWBIO公司，超微量分光光度計(jì)Quawell-Q5000購(gòu)自北京鼎盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，PCR儀T100購(gòu)自上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.3 基因組DNA的提取 根據(jù)AxyPrep基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取99頭延黃牛牛耳組織基因組DNA，采用Quawell-Q5000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度及純度，并取3 μL進(jìn)行電泳定性檢測(cè)DNA。

1.4 DNA引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù) GenBank 中發(fā)表的牛ALDH1A1基因DNA序列（登錄號(hào)：NW_003104101.1），通過(guò)UCSC查找基因外顯子，共發(fā)現(xiàn)ALDH1A1基因含有13個(gè)外顯子，用Primer5.0設(shè)計(jì)引物，引物信息見(jiàn)表1。引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.5 PCR反應(yīng)體系及條件 PCR反應(yīng)體系（20 μL）：2×Taq Master Mix10 μL，DNA 1 μL， 上、 下 游 引 物 各 0.5 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)條件：95 預(yù)變性2 min；95變性30 s；退火（見(jiàn)表1）30 s，72 延伸30 s，共34個(gè)循環(huán)；72 終延伸5 min，產(chǎn)物4 保存。

1.6 延黃牛ALDH1A1基因多態(tài)性檢測(cè) 對(duì)99頭延黃牛DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)取 3 μL進(jìn)行電泳檢測(cè)，剩余PCR產(chǎn)物由蘇州金唯智生物科技有限公司Sanger直接測(cè)序。利用DNAman軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果逐一進(jìn)行分析尋找SNP位點(diǎn)，用Chromas對(duì)測(cè)序結(jié)果波峰圖進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算基因型和基因型頻率。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 利用 SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，以確定單個(gè)基因型與肉用性狀的相關(guān)性。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。1.8 基因（型）頻率及遺傳多態(tài)性統(tǒng)計(jì)分析 通過(guò)基因（型）頻率計(jì)算遺傳純合度（Ho）、遺傳雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）和多態(tài)信息含量（PIC）。

表1 引物序列信息

式中，n為等位基因數(shù)；Pi、Pj為第i、j個(gè)等位基因頻率。PIC＜0.25為低度多態(tài)；PIC＞0.5為高度多態(tài)；0.25＜PIC＜0.5為中度多態(tài)。

2 結(jié) 果

2.1 延黃牛ALDH1A1基因PCR擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ALDH1A1基因第4外顯子片段長(zhǎng)度約為443 bp，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致（圖1）。

圖1 延黃牛ALDH1A1基因第4外顯子PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 序列分析 對(duì)測(cè)序結(jié)果的分析比對(duì)發(fā)現(xiàn)，僅在ALDH1A1基因第4外顯子編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)G/T突變，其余外顯子未發(fā)現(xiàn)突變（圖2），利用Chromas軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果波峰圖依次比對(duì)確定ALDH1A1基因第4外顯子基因型，與 GenBank（登錄號(hào)：NW_003104101.1）序列反向互補(bǔ)相同序列的定義為TT基因型，雜合子為TG基因型，未發(fā)現(xiàn)GG基因型（圖3）。該突變導(dǎo)致氨基酸酪氨酸（Y）發(fā)生改變（圖4）。

2.3 延黃牛ALDH1A1基因遺傳學(xué)分析 對(duì)ALDH1A1基因第4外顯子TT和TG基因型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，TT和TG的基因型頻率分別為79.80 %和20.20 %，TT為優(yōu)勢(shì)基因型；T和G基因頻率分別為89.9 %和10.1 %，T為優(yōu)勢(shì)等位基因（表2）。由表3可知，ALDH1A1基因第4外顯子T/G突變位點(diǎn)的He相對(duì)較低，表明其在延黃牛群體中的變異較??；PIC為0.166（PIC＜0.25），表現(xiàn)為低度多態(tài)，說(shuō)明上述遺傳標(biāo)記能夠提供少量的遺傳信息。

圖2 延黃牛ALDH1A1基因第4外顯子序列比對(duì)結(jié)果

圖3 TT和TG的測(cè)序波峰圖

圖4 ALDH1A1基因第4外顯子氨基酸序列與原氨基酸序列比對(duì)圖

表2 延黃牛ALDH1A1基因第4外顯子基因型頻率及其基因頻率

表3 ALDH1A1基因4號(hào)外顯子在延黃牛上的遺傳特性

2.4 延黃牛ALDH1A1基因第4外顯子不同基因型與體尺、肉質(zhì)性狀的相關(guān)性分析 如表4所示，ALDH1A1基因第4外顯子不同基因型與延黃牛體尺性狀中的十字部高、胸圍、腹圍和管圍存在顯著相關(guān)（P＜0.05），與肉質(zhì)性狀中的背膘厚存在顯著相關(guān)（P＜0.05），與肌內(nèi)脂肪具有一定的相關(guān)性（P＞0.05）。

3 討 論

乙醛脫氫酶超家族（ALDHs）可以通過(guò)編碼一類NAD（P）+依賴的酶，將外源性和內(nèi)源性的醛類脂肪族和醛類芳香族氧化為相應(yīng)的羧酸[14]。ALDH1A1作為該家族中的重要一員，在視黃醛代謝和維甲酸代謝通路的活化中發(fā)揮著重要的作用，還是脂類代謝通路的關(guān)鍵基因。本研究在延黃牛ALDH1A1基因第4外顯子處發(fā)現(xiàn)T/G突變，TT為優(yōu)勢(shì)基因型（79.80%），T為優(yōu)勢(shì)等位基因（89.90%），該位點(diǎn)的突變引起氨基酸Y（酪氨酸）的改變，而酪氨酸是一種非必需氨基酸，是構(gòu)成蛋白質(zhì)的主要氨基酸，即參與生糖反應(yīng)也參與生酮反應(yīng)，推測(cè)TT基因型可能是影響延黃牛脂肪酸代謝的關(guān)鍵基因型。但是該突變位點(diǎn)的He相對(duì)較低，表明其在延黃牛群體中的變異較??；PIC為0.166（PIC＜0.25），表現(xiàn)為低度多態(tài)，說(shuō)明該遺傳標(biāo)記能夠提供少量的遺傳信息[15]。TT基因型是否是影響延黃牛脂肪酸代謝的關(guān)鍵基因型，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)量進(jìn)行系統(tǒng)的分析。通過(guò)對(duì)ALDH1A1基因第4外顯子不同基因型與延黃牛體尺和肉質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，ALDH1A1基因第4外顯子不同基因型與延黃牛體尺性狀中的十字部高、胸圍、腹圍和管官圍存在顯著相關(guān)，與肉質(zhì)性狀中的背膘厚存在顯著相關(guān)，與肌內(nèi)脂肪具有一定的相關(guān)性。Gagaoua等[16]通過(guò)反相蛋白陣列（RPPA）定量了29個(gè)蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)ALDH1A1基因與牛肉質(zhì)鮮嫩和多汁有關(guān)，并被證實(shí)為牛肉質(zhì)的主要生物標(biāo)志物。Moreb等[17]采用寡核苷酸微陣列分析的方法對(duì)肺癌細(xì)胞系中基因譜的變化進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ALDH1A1基因與脂質(zhì)代謝、細(xì)胞增殖、遷移和粘附有關(guān)。更有學(xué)者通過(guò)研究小鼠和人細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，ALDH1A1和ALDH1A3是癌癥干細(xì)胞（CSC）和正常組織干細(xì)胞（SC）的標(biāo)志物，并且參與細(xì)胞的自我更新、自我分化和自我保護(hù)[18]。ALDH1A1基因第4外顯子多態(tài)性是否對(duì)延黃牛體尺和肉質(zhì)性狀有影響，是否能作為一個(gè)肉質(zhì)改良的標(biāo)記，還需要進(jìn)一步深入研究。本課題組下一步將驗(yàn)證該基因是否對(duì)延黃牛皮下脂肪細(xì)胞有影響。

表4 延黃牛ALDH1A1基因第4外顯子不同基因型與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性分析結(jié)果

目前，ALDH1A1的研究只局限于人類癌癥[19]、代謝性疾病和神經(jīng)性疾病[20]方面，對(duì)脂肪酸代謝、視黃醛代謝和維甲酸代謝通路的影響尚未深入研究。本研究通過(guò)對(duì)延黃牛ALDH1A1基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)及其與延黃牛肉用性狀的關(guān)聯(lián)分析，為今后延黃牛肉質(zhì)改良有效遺傳標(biāo)記的篩選提供參考依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)延黃牛ALDH1A1基因13個(gè)外顯子進(jìn)行SNP位點(diǎn)檢測(cè)，經(jīng)分析在第4外顯子處檢測(cè)到T/G突變，且引起編碼氨基酸的改變，但該突變位點(diǎn)的He相對(duì)較低，在延黃牛群體中的變異較小，屬于低度多態(tài)（PIC＜0.25），僅能提供少量遺傳信息。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，ALDH1A1基因第4外顯子不同基因型與延黃牛體尺性狀中的十字部高、胸圍、腹圍和管圍存在顯著相關(guān)，與肉質(zhì)性狀中的背膘厚存在顯著相關(guān)，與肌內(nèi)脂肪具有一定的相關(guān)性。綜上所述，ALDH1A1基因外顯子在延黃牛中存在多態(tài)性，且與延黃牛體尺和部分肉質(zhì)性狀存在顯著性差異，能否作為延黃牛肉質(zhì)和體尺性狀的遺傳標(biāo)記有待于擴(kuò)大樣本數(shù)量進(jìn)一步驗(yàn)證。