張旭戈，周珊，傅少志，苗洪賓，劉彥婷，覃綱

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院1.耳鼻咽喉頭頸外科，2.腫瘤科，四川 瀘州 646000）

多重耐藥嚴(yán)重影響鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）患者的預(yù)后，尋找提高NPC化療敏感性的靶點可能是提高其療效的突破點。近年來，有文獻(xiàn)報道肝激酶B1（liver kinase B1, LKB1）在肺癌等多種惡性腫瘤中突變或缺失，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移[1]，且其下游靶點腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）的激活可增加化療藥物的敏感性[2]，而LKB1在NPC組織中的表達(dá)及與化療的研究則鮮有報道。本課題通過檢測NPC組織中LKB1的表達(dá)水平，分析其與患者臨床病理因素、預(yù)后及化療敏感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2014年3月—2016年8月在西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院首次經(jīng)組織活檢確診并治療的NPC患者74例，收集各例患者的新鮮活檢腫瘤組織和腫瘤組織石蠟塊。其中，男性52例，女性22例；年齡21～77歲，中位年齡49歲。病理組織學(xué)分型：角化性鱗狀細(xì)胞癌5例，非角化分化型癌31例，非角化未分化型癌38例。按照國際抗癌聯(lián)盟（UICC）和美國癌癥分期聯(lián)合委員會（AJCC）第7版（2010）方案進行NPC的TNM分期，臨床分期：Ⅰ期3例，Ⅱ期9例，Ⅲ期48例，Ⅳ期14例。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①所有患者術(shù)前未行放化療，首次經(jīng)本院病理科確診為NPC并治療；②未合并其他惡性腫瘤，具備完整的臨床及病理資料；③石蠟切片質(zhì)量佳，隨訪資料完整。本課題經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者在術(shù)前簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗人LKB1多克隆抗體（abs124916a，上海Absin生物科技有限公司），Envision免疫組織化學(xué)法檢測試劑（K5007，丹麥Dako公司），氟尿嘧啶、奧沙利鉑及環(huán)磷酰胺購自連云港市恒瑞醫(yī)藥公司，順鉑和卡鉑購自濟南市齊魯制藥有限公司，紫杉醇（北京協(xié)和藥廠），多西他賽和吉西他濱購自連云港市豪森藥業(yè)股份有限公司，ATP生物熒光腫瘤體外藥敏檢測技術(shù)（ATP-TCA）試劑盒（北京金紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司），倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；微孔板發(fā)光儀（北京濱松光子技術(shù)有限公司）。

1.3 免疫組織化學(xué)Envision二步法

取組織石蠟塊，3μm厚切片，常規(guī)脫蠟，依次在EDTA修復(fù)液（pH=9.0）、檸檬酸鹽修復(fù)液（pH=6.0）中高壓抗原修復(fù)，3%甲醇H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline,PBS）沖洗。依次滴加用PBS稀釋為1∶200的兔抗人LKB1多克隆抗體，37℃孵育1 h；PBS沖洗，滴加二抗，37℃孵育30 min；PBS沖洗，DAB顯色，自來水沖洗終止顯色；流水沖洗，蘇木精復(fù)染。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。

LKB1染色為黃色或者棕黃色，所有切片在同一顯微鏡200倍視野下調(diào)整相同曝光強度、關(guān)閉自動白平衡功能，只調(diào)整焦距和視野，隨機選取5個視野拍照；將Image Pro Plusversion 6.0（IPP）專業(yè)圖像分析軟件的灰度單位轉(zhuǎn)換成光密度單位，測量切片的面積（area）、累積光密度 （integrated optical density, IOD），計算平均光密度值（mean optical density, MOD），進行半定量統(tǒng)計分析。MOD=總IOD/總area。

NPC中LKB1高、低表達(dá)分組：以所測NPC的MOD中位數(shù)為界限，小于中位數(shù)為低表達(dá)，大于或等于中位數(shù)為高表達(dá)。

1.4 化療藥物敏感實驗

嚴(yán)格按照ATP-TCA試劑盒說明書進行操作。取部分新鮮活檢標(biāo)本消化重懸成單細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為 2×105～ 4×105/ml，取100μl接種于 96孔培養(yǎng)板，加入抗腫瘤藥物（實驗組），每種藥物設(shè)置5個測試濃度：200.0%、100.0%、50.0%、25.0%和12.5%PPC。PPC為根據(jù)待測藥物的臨床使用劑量所對應(yīng)的血漿峰值濃度（peak plasma concentration, PPC）。2個對照組：不加任何抗腫瘤藥物的對照組（M0）、加入最大ATP抑制劑的對照組（M1），將各組培養(yǎng)板置于37℃、5%二氧化碳CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 d，加入50μl/孔 ATP提取液，吹打混勻，再取50μl混合上清液置于對應(yīng)的微孔板內(nèi)，最后加入50μl/孔發(fā)光工作液，震蕩檢測。

1.4.1 評價標(biāo)準(zhǔn) 強敏感（SS）：IC50≤25% PPC和IC90≤100% PPC；中度敏感（IS）：IC50≤25%PPC 和 IC90＞100% PPC；輕度敏感（MS）：IC50＞25%PPC和IC90≤100% PPC；耐藥R：IC50＞25% PPC和IC90＞100% PPC。IC50、IC90分別為抑制 50% 腫瘤細(xì)胞生長時的血漿峰值濃度和抑制90%腫瘤細(xì)胞生長時的血漿峰值濃度[3]。

1.5 隨訪

所有患者以門診復(fù)查或回訪電話的方式進行隨訪，隨訪截止時間2017年11月30日。無進展生存期為患者從確診NPC后首次住院至確診腫瘤進展、患者死亡或末次隨訪時的總時間?？偵嫫跒榛颊邚氖状巫≡捍_診為NPC至任何原因引起的死亡或末次隨訪的總時間。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以構(gòu)成比（%）表示，比較用χ2檢驗；計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NPC組織中LKB1的表達(dá)

免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示，在LKB1高表達(dá)的NPC組織中，LKB1蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，呈棕黃色（見圖1）。半定量統(tǒng)計分析結(jié)果表明，74例NPC患者中，LKB1蛋白的MOD中位數(shù)為0.146，LKB1低表達(dá)組與LKB1高表達(dá)組MOD比較，經(jīng)獨立樣本t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.180，P=0.000），LKB1 低表達(dá)組 MOD（0.122±0.019）低于LKB1高表達(dá)組的MOD（0.165±0.017）。見圖2。

2.2 NPC患者LKB1表達(dá)水平與臨床病理因素的關(guān)系

74例NPC組織中，LKB1高、低表達(dá)組患者性別、年齡、病理類型、T分期、N分期、M分期和臨床分期比較，經(jīng)χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。兩組患者性別比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見附表。

圖1 LKB1在NPC組織中的表達(dá) （Envision二步法）

圖2 NPC組織中不同LKB1表達(dá)組的MOD比較 （±s）

2.3 NPC組織對化療藥物的敏感性

74例NPC組織對氟尿嘧啶、奧沙利鉑、卡鉑、紫杉醇、環(huán)磷酰胺、吉西他濱、順鉑和多西他賽8種化療藥物的敏感性比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=47.226，P=0.000），NPC組織對卡鉑的敏感性最高。見圖3。

2.4 NPC組織LKB1表達(dá)水平與化療藥物耐藥率的關(guān)系

LKB1低表達(dá)組與LKB1高表達(dá)組的環(huán)磷酰胺耐藥率比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.186，P=0.013），LKB1低表達(dá)組高于LKB1高表達(dá)組。其余7種化療藥物的耐藥率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖 4。

附表 NPC患者LKB1表達(dá)水平與臨床病理因素的關(guān)系 [n =37，例（%）]

圖3 NPC組織對化療藥物的敏感性比較

圖4 NPC組織LKB1表達(dá)水平與化療藥物耐藥率的關(guān)系

2.5 NPC組織LKB1表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系

LKB1低表達(dá)組患者的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率（45.95%）與高表達(dá)組（40.54%）比較，經(jīng)χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.220，P=0.639）（見圖 5）。LKB1低表達(dá)組的死亡率為40.54%，LKB1高表達(dá)組為18.92%，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.140，P=0.042），LKB1低表達(dá)組高于高表達(dá)組（見圖6）。

圖5 兩組患者的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率比較 （±s）

圖6 兩組患者的死亡率比較 （±s）

LKB1低表達(dá)組患者的無進展生存率與高表達(dá)組比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.644，P=0.200）（見圖7）。兩組患者的總生存率比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.385，P=0.020），LKB1低表達(dá)組低于高表達(dá)組（見圖8）。

圖7 兩組患者的無進展生存率比較 （±s）

圖8 兩組患者的總生存率比較 （±s）

3 討論

NPC是我國常見的頭頸部惡性腫瘤之一，惡性程度高，早期易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。目前采用以放療為主的綜合治療，放化療與單純放療后的5年生存率分別為95%和86%[4-6]，故放化療在多數(shù)治療中可取得較好的療效，并逐漸成為主要治療方案[5]。但仍然存在治療失敗，其中對化療藥物的耐藥是治療失敗的重要原因之一。因此，尋找增加化療敏感性的標(biāo)志物，對提高NPC的預(yù)后有重要的意義。

LKB1基因為一種抑癌基因，通過原位雜交技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)幾乎在人體的所有組織中有LKB1 mRNA的表達(dá)[6]。近年研究表明，LKB1在多種惡性腫瘤中存在缺失或突變，參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。LKB1/AMPK信號通路能調(diào)控腫瘤細(xì)胞的G1期，阻滯細(xì)胞周期，影響腫瘤細(xì)胞的生長[7]。有學(xué)者證實，激活A(yù)MPK的表達(dá)能夠提高膀胱癌對化療藥物的敏感性[8]。在非小細(xì)胞肺癌中，LKB1通過下調(diào)mTOR等的表達(dá)，增加對化療藥物順鉑的敏感性[9]。與此類似，LKB1可促進卵巢癌細(xì)胞SIK1表達(dá)，明顯抑制其細(xì)胞的生長、侵襲，促進細(xì)胞的凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)，采用siRNA干擾技術(shù)敲除卵巢癌細(xì)胞中LKB1表達(dá)，能提高轉(zhuǎn)化生長因子-β和EMT的表達(dá)，進一步降低卵巢癌細(xì)胞對化療的敏感性；同樣，構(gòu)建重組質(zhì)粒使LKB1過表達(dá)，能增加化療敏感性，顯著地抑制細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。然而，LKB1在NPC組織中的表達(dá)及與化療敏感性關(guān)系的研究則鮮有報道。

本實驗通過免疫組織化學(xué)法對74例NPC組織中LKB1的表達(dá)進行檢測，發(fā)現(xiàn)LKB1蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，LKB1高、低表達(dá)組間性別比較有差異，而兩組其他臨床因素比較無差異；LKB1低表達(dá)組的死亡率高于高表達(dá)組，LKB1低表達(dá)組的總生存率低于高表達(dá)組，但兩組患者腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率、無進展生存率無差異。該結(jié)果與唐亮等[11]的研究不完全一致，可能是因為選擇NPC標(biāo)本的差異及隨訪時間不同等。本實驗主要研究LKB1在NPC組織中高、低兩組表達(dá)的情況，以及與臨床因素、化療藥物敏感性及預(yù)后的關(guān)系。程忠強等[12]的研究證明，鼻咽黏膜慢性炎癥組織中LKB1的表達(dá)水平高于NPC組織，所以本實驗未選取鼻咽黏膜慢性炎癥組織作為對照組。

本實驗發(fā)現(xiàn)，74例NPC組織細(xì)胞對臨床上常用的8種化療藥物（氟尿嘧啶、奧沙利鉑、卡鉑、紫杉醇、環(huán)磷酰胺、吉西他濱、順鉑和多西他賽）均敏感，其中對鉑類化療藥物最敏感，與2017年NCCN指南中放化療方案中常用鉑類藥物對應(yīng)[13]。進一步將研究的NPC組織分成LKB1高、低表達(dá)組，比較兩組間8種化療藥物敏感性的差異，發(fā)現(xiàn)LKB1表達(dá)差異只與環(huán)磷酰胺敏感性有關(guān)，與余下7種化療藥物無關(guān)，并且與LKB1高表達(dá)NPC患者比較，LKB1低表達(dá)NPC患者死亡率增加，總生存率降低，可能與LKB1調(diào)控及抑制化療藥物的敏感性有關(guān)。環(huán)磷酰胺是烷化劑類中的一種細(xì)胞周期非特異性抗腫瘤藥物，不僅能作用于腫瘤細(xì)胞周期，調(diào)控細(xì)胞的凋亡，而且還能通過下調(diào)VEGF，參與抗血管生成的作用[14-15]。LKB1可通過激活A(yù)MPK，下調(diào)mTOR表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和生長[16]。而CEJKA等[17]研究發(fā)現(xiàn)，采用mTOR抑制劑依維莫司,可以增加化療藥物烷化劑環(huán)磷酰胺的敏感性。因此，推測低表達(dá)LKB1可能通過抑制AMPK/mTOR信號通路導(dǎo)致NPC對環(huán)磷酰胺耐藥。LKB1能否作為臨床上NPC患者提高環(huán)磷酰胺治療敏感性的分子靶點及其具體機制，尚待進一步研究。

本實驗通過檢測LKB1蛋白在NPC中的表達(dá)，分析LKB1表達(dá)與NPC患者臨床病理因素、化療敏感性及預(yù)后的關(guān)系，初步證實LKB1在NPC中的低表達(dá)降低了患者總生存率，并導(dǎo)致對環(huán)磷酰胺耐藥，但具體調(diào)節(jié)的機制有待進一步研究。