盧北玲，史劍飛，周軍

（1.陜西省西安市中醫(yī)醫(yī)院 檢驗科，陜西 西安 710001；2.陜西省西安市兒童醫(yī)院 檢驗科，陜西 西安 710003；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心，湖南 長沙 410008）

鉛是廣泛存在于自然界的一種重金屬，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害是不可逆的[1]。鉛暴露造成幼腦學(xué)習(xí)能力下降，但卻鮮有文獻解釋成年人在鉛暴露環(huán)境下的變化，以及不同時間的鉛暴露對大腦功能的影響是否一致。文獻報道主要集中在鉛對腦海馬區(qū)的損傷，很少對腦皮質(zhì)功能的改變進行研究[1-3]。本實驗將豚鼠在含鉛環(huán)境暴露不同時間后，對皮質(zhì)表達的自噬蛋白進行分析，為早期預(yù)防鉛暴露危害提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年豚鼠，雌雄不限，體重400～500 g，SPF清潔級，由中南大學(xué)實驗動物學(xué)部提供。全部實驗動物在適應(yīng)性飼養(yǎng)5～7 d后用于實驗，分籠飼養(yǎng)，12 h晝/夜循環(huán)照明，自由飲食和飲水，室溫（20±2）℃。

1.2 主要儀器與試劑

0.2%醋酸鉛溶液（上海碧云天生物公司），ATG5（NB100-53818）、Beclin1（NBP1-00085）、LC3B（NB100-2220）購自美國Novus公司，多功能酶標儀（M200pro，奧地利Tecan 公司），石蠟包埋機（EG1150）、倒置顯微鏡（DM2000）購自德國Leica公司。

1.3 實驗動物分組與處理

18只成年豚鼠隨機分為4組：對照組（3只），以及鉛暴露15、60和90 d組（每組5只）。對照組給予等量的生理鹽水，鉛暴露組用0.2%醋酸鉛飲用水喂養(yǎng)豚鼠。喂養(yǎng)不同時間后對動物進行麻醉，斷頭取腦，立即放入4%多聚甲醛溶液中進行固定、脫水、石蠟包埋、切片。

1.4 免疫組織化學(xué)法

石蠟切片在烤箱烤干后，進行脫蠟及水化，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline, PBS）浸泡切片2、3次，5～10 min/次，用3% GS或10% HS封閉40 min，PBS洗3次，加入抗ATG5（1∶500）、Beclin1（1∶500）、LC3B（1∶500）4℃孵育過夜，次日用PBS洗3次，10 min/次，加入相對應(yīng)的二抗（1∶400）室溫孵育2 h，PBS洗3次，用DAB進行顯色。在顯微鏡下觀察，直到出現(xiàn)滿意的顏色，脫水、封片、晾干后用普通倒置顯微鏡對大腦皮質(zhì)區(qū)（根據(jù)海馬區(qū)情況進行皮質(zhì)區(qū)的視野選取，在拍照過程中選取海馬周邊的皮質(zhì)區(qū)進行拍照，每張片子保持一樣的腦皮質(zhì)位置）進行拍片統(tǒng)計（不連續(xù)的3～5個視野）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用Graphpad prism 6.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時間鉛暴露后豚鼠腦皮質(zhì)區(qū)ATG5的陽性表達比較

ATG5陽性表達在細胞質(zhì)或細胞膜。對照組，以及鉛暴露15、60和90 d組的ATG5陽性細胞數(shù)分別為（87.08±53.27）、（86.38±48.18）、（93.77±43.45）和（152.08±44.32）個/HP，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.643；P=0.005）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，鉛暴露90 d組高于對照組（P＜0.05）；對照組與其余各組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，不同時間鉛暴露后，ATG5有不同程度的升高，但鉛暴露90 d組升高最明顯，推測ATG5在鉛暴露后早期可能起保護大腦組織的作用，而隨著鉛暴露時間的延長，ATG5蛋白表達更加明顯，引起腦神經(jīng)細胞的損傷。見圖1、2。

2.2 不同時間鉛暴露對豚鼠大腦皮質(zhì)Beclin 1蛋白表達的影響

Beclin 1蛋白定位在神經(jīng)元胞質(zhì)或細胞膜。對照組，以及鉛暴露15、60和90 d組的Beclin 1陽性細 胞 數(shù) 分 別 為（32.00±23.89）、（108.31±35.25）、（123.85±33.82）和（126.62±26.77）個/HP，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=25.910；P=0.000）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，對照組與其他組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；鉛暴露15、60和90 d組組間兩兩比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。但是隨著鉛暴露時間延長，Beclin1陽性細胞數(shù)也升高，可見隨著鉛暴露時間延長，自噬蛋白Beclin1的表達升高。見圖3、4。

圖1 各組豚鼠腦皮質(zhì)區(qū)ATG5的表達 （免疫組織化學(xué)法×200）

圖2 各組豚鼠ATG5陽性細胞數(shù)比較 （±s）

2.3 慢性鉛暴露下豚鼠大腦皮質(zhì)LC3B的表達變化

腦皮質(zhì)區(qū)自噬蛋白LC3B主要表達在細胞膜，陽性細胞呈現(xiàn)棕黃色。對照組，以及鉛暴露15、60和90 d組的LC3B陽性細胞數(shù)分別為（59.38±12.18）、（103.46±33.96）、（107.38±70.27）和（118.08±38.91）個/HP，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=7.575；P=0.002）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，對照組與其他組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；鉛暴露15、60和90 d組組間兩兩比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果提示，鉛飲用水可引起大腦皮質(zhì)區(qū)LC3B升高。LC3B陽性表達與Beclin1的變化趨勢一致。見圖5、6。

圖3 各組豚鼠腦皮質(zhì)區(qū)Beclin1的表達 （免疫組織化學(xué)法×200）

圖4 各組豚鼠Beclin1陽性細胞數(shù)比較 （±s）

圖5 各組豚鼠腦皮質(zhì)區(qū)LC3B的表達 （免疫組織化學(xué)法×200）

圖6 各組豚鼠LC3B陽性細胞數(shù)比較 （±s）

3 討論

人類鉛暴露通常來自于水、空氣及土壤污染，長期處在高鉛環(huán)境中將會損害大腦發(fā)育，包括細胞增殖等，但是其具體作用機制并不清楚，仍然是亟待解決的健康問題[2]。鉛具有很強的親組織性和神經(jīng)毒性，且血鉛濃度升高是導(dǎo)致神經(jīng)不可修復(fù)，以及兒童生理和行為障礙的關(guān)鍵原因。自噬水平升高可能是一種代償性的保護效應(yīng)，但在自噬反應(yīng)超過某一閾值，表現(xiàn)為過度激活的情況下，會進一步損傷細胞器并促發(fā)自噬性細胞死亡[3]。自噬是真核細胞中廣泛存在的降解系統(tǒng)，在自噬過程中，大部分胞質(zhì)蛋白和損害的細胞器通過溶酶體聚集和降解，但是對應(yīng)激和損傷的過度自噬反應(yīng)會導(dǎo)致自噬性細胞死亡，說明自噬在組織細胞清除中起雙刃劍的作用[4]。有研究指出，自噬是細胞死亡的誘發(fā)因素[5]。暴露于鉛環(huán)境的動物與人腦組織中均可觀察到老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)[6]。重金屬鉛仍是構(gòu)成環(huán)境有毒物質(zhì)的危險因素，但是沒有研究指出鉛是阿爾茨海默病或Tau蛋白形成的誘因。對年齡＞65歲老人進行橫向研究發(fā)現(xiàn)，血液中高水平鉛組認知能力明顯下降[7]。鉛很容易通過胎盤屏障，尤其是鼠受孕期處于鉛暴露環(huán)境中，會對子鼠的行為學(xué)發(fā)育造成不可逆的損害；在鉛暴露停止后，這些行為學(xué)改變會繼續(xù)持續(xù)很長時間，還可引起膽堿能系統(tǒng)的改變[8]。妊娠期或哺乳期接觸鉛會引起胎兒神經(jīng)元氧化應(yīng)激，導(dǎo)致大腦認知相關(guān)蛋白水平改變，且胎兒大腦發(fā)育過程中對毒性鉛有易感性，導(dǎo)致新生的神經(jīng)元增殖或神經(jīng)元突觸連接發(fā)生中斷[9]。Beclin1可能在自噬和凋亡2種程序性細胞死亡中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[10]。

本實驗中，豚鼠在不同時間鉛暴露后ATG5、Beclin1和LC3B的表達水平較對照組升高，進一步說明大腦組織中自噬相關(guān)蛋白對神經(jīng)元起調(diào)節(jié)作用。鐵可降低動物血液和腦組織的鉛濃度，在一定程度下對大腦具有保護性效應(yīng)，可能是因為鉛鐵離子傾向于引起氧化性效應(yīng)而不是神經(jīng)中和效應(yīng)[11]。在發(fā)育時期鉛暴露可降低突觸的可塑性，造成認知功能和行為學(xué)紊亂，這是早期生命鉛暴露導(dǎo)致的最常見的效應(yīng)，且鉛暴露效應(yīng)對負責(zé)空間記憶和理解的大腦海馬區(qū)更易產(chǎn)生影響[12]。鉛可促進原代大鼠近端腎小管細胞（proximal tubular, PT）中自噬溶酶體的聚集，且自噬蛋白的增多和溶酶體膜透化對腎小管細胞的凋亡抑制作用促進了鉛的腎小管毒性[13]。自噬和細胞凋亡是細胞發(fā)展的2種結(jié)果，鉛抑制PT細胞自噬的降解，然而自噬降解抑制劑加重鉛誘導(dǎo)的細胞凋亡，自噬與凋亡的相互聯(lián)系有助于進一步了解鉛誘導(dǎo)的腎毒性的具體機制[14]。

在鉛暴露環(huán)境中，女性更容易患阿爾茨海默癥，所以需要進一步探索鉛暴露對胚胎期小鼠引發(fā)的危險[15]。神經(jīng)干細胞在大腦發(fā)育過程中扮演重要角色，鉛可以阻斷其功能，可能是鉛誘導(dǎo)紅系衍生的核轉(zhuǎn)錄因子2誘導(dǎo)依賴的轉(zhuǎn)錄性反應(yīng)，導(dǎo)致分泌型磷蛋白1的上調(diào)[16]。自噬參與自噬溶酶體的形成，而且自噬溶酶體已經(jīng)被廣泛用于Caspase非依賴的細胞死亡通路，與大腦缺血再灌注損傷有關(guān)，而且干擾RNA介導(dǎo)的Beclin1表達下降減弱了大鼠的腦缺血損傷，這可能與

降低凋亡，促進神經(jīng)再生有關(guān)，因此Beclin1的降低有助于改善中風(fēng)患者的病情[17]。有研究證明，鉛可能會損害人和動物的免疫系統(tǒng)，鉛可誘導(dǎo)細胞氧化性應(yīng)激，影響線粒體的動態(tài)平衡和自噬反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致脾臟的免疫紊亂[18]。還有研究證實，在代謝應(yīng)激的情況下，ATG7通過調(diào)節(jié)p53的活性來調(diào)節(jié)細胞周期和細胞活性[19]。但也有研究指出，大腦海馬和皮質(zhì)區(qū)的自噬標志物表達有明顯區(qū)別，在氧糖剝得模型誘導(dǎo)后的早期，皮質(zhì)區(qū)出現(xiàn)自噬反應(yīng)但海馬區(qū)無，且自噬抑制劑的使用阻斷其誘發(fā)的谷氨酸釋放效應(yīng)[20]。本實驗選取不同時間鉛暴露后豚鼠的大腦皮質(zhì)區(qū)，進一步探討環(huán)境鉛對成年鼠引發(fā)的自噬反應(yīng)，對鉛接觸的早期預(yù)防提供實驗依據(jù)。