王鑫，申傳安，趙東旭

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院培養(yǎng)基地，遼寧 錦州121001；2.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院 燒傷整形科，北京 100048）

醫(yī)學(xué)生物的實(shí)驗(yàn)研究一般由分子細(xì)胞生物研究到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，最終進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)，其中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究通常是模擬人體實(shí)驗(yàn)，是進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)不可替代的準(zhǔn)備環(huán)節(jié)[1]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，大鼠具有經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、容易取得、抗病能力強(qiáng)、繁殖快、方便飼養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)常被作為醫(yī)學(xué)疾病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯繉?duì)象。創(chuàng)面組織修復(fù)研究領(lǐng)域有眾多關(guān)于大鼠創(chuàng)面模型的報(bào)道[2-3]，然而嚙齒類動(dòng)物深度創(chuàng)面的愈合方式主要靠皮膚收縮，與人類創(chuàng)面通過肉芽組織形成和表皮細(xì)胞再生的愈合機(jī)制不同[4]。另外，大鼠身體柔韌，可以舔咬自身創(chuàng)面，其創(chuàng)面敷料、移植皮片及縫合線容易被咬掉。既往研究應(yīng)用胸骨鋼絲阻隔圈，避免皮膚攣縮和自咬現(xiàn)象影響創(chuàng)面實(shí)驗(yàn)效果[5]。本實(shí)驗(yàn)就具體的實(shí)驗(yàn)操作細(xì)節(jié)再次進(jìn)行深入探究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取健康成年的清潔級(jí)SD雌性大鼠24只，體重230～250 g，由解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。隨機(jī)分為A、B、C組，每組8只。A組為傳統(tǒng)抗攣縮創(chuàng)面并進(jìn)行植皮；B組為改良方法復(fù)制創(chuàng)面并進(jìn)行植皮；C組為空白對(duì)照，為改良方法復(fù)制創(chuàng)面但不植皮。

1.2 主要儀器

采用直徑0.7 mm胸骨鋼絲制成3.6 cm×3.6 cm的鋼絲框，4號(hào)絲線，7號(hào)絲線，縫合針，手術(shù)器械。

1.3 動(dòng)物創(chuàng)面模型的復(fù)制

實(shí)驗(yàn)大鼠經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉（0.10～0.15 ml/100 g）麻醉，背部涂抹溫肥皂水，用剃刀刮毛，用Mark筆在背部畫邊長(zhǎng)為3.6 cm的正方形。A組位置標(biāo)記在背部近尾端（見圖1A）；B組位置標(biāo)記在背部近頭端（見圖1B）；C組為空白對(duì)照，創(chuàng)面位置同B組，不進(jìn)行植皮。碘伏消毒2遍，鋪無菌洞巾，用手術(shù)刀切開皮膚，剪下標(biāo)記的正方形皮膚，創(chuàng)面暴露至深筋膜層，用生理鹽水紗布包裹所剪皮膚備用。另外，將3 cm×3 cm紗布用生理鹽水浸濕后，覆蓋創(chuàng)面進(jìn)行保護(hù)。將滅菌的3.6 cm×3.6 cm鋼圈埋于創(chuàng)緣皮膚下。A組用4號(hào)絲線直接縫合一圈，縫針由皮膚外側(cè)穿透皮膚，由皮膚內(nèi)側(cè)出針越過鋼絲，再從內(nèi)側(cè)進(jìn)針穿出皮膚，在外側(cè)打結(jié)剪線，即可將鋼圈固定，針距約6 mm（見圖2A）。B組用7號(hào)絲線改良縫合方法縫合鋼圈，先行單純固定鋼圈縫合（同A組），在完成打結(jié)固定后暫不剪線，越過創(chuàng)緣由內(nèi)側(cè)再次進(jìn)針，進(jìn)針點(diǎn)在鋼圈外側(cè)，穿透皮膚后由外側(cè)出針，再次進(jìn)行打結(jié)后剪線（見圖2B）；C組縫合鋼圈同B組（見圖2C）。A、B組均縫合24針固定鋼圈。修剪所取皮膚的皮下組織并制成1∶6放大的MEEK微型皮片，剪下3.6 cm×3.6 cm粘貼有邊長(zhǎng)為3 mm小皮片的MEEK縐紗，用生理鹽水浸濕后回植創(chuàng)面。用0號(hào)絲線在靠近4個(gè)角和中心部的無皮片區(qū)進(jìn)行縫合，以固定縐紗。C組縫合鋼圈后不植皮，直接油紗覆蓋。3組最后用多層紗布覆蓋后再進(jìn)行打包固定。術(shù)后每只大鼠腹腔注射10 ml生理鹽水補(bǔ)液，單籠飼養(yǎng)。

圖1 A、B組大鼠創(chuàng)面位置

圖2 3組大鼠創(chuàng)面抗攣縮框縫合效果

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 創(chuàng)面收縮情況 術(shù)后7、14和21 d對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行拍照，運(yùn)用ImageJ Fiji圖像分析軟件測(cè)量創(chuàng)面面積，計(jì)算創(chuàng)面收縮率。創(chuàng)面收縮率=四周皮膚越過鋼圈生長(zhǎng)面積/原創(chuàng)面面積×100%。

1.4.2 鋼圈脫出及線結(jié)脫落情況 術(shù)后21 d用ImageJ Fiji圖像分析軟件測(cè)量每只大鼠脫出的鋼絲圈長(zhǎng)度，計(jì)數(shù)剩余線結(jié)數(shù)。

1.4.3 移植皮片生長(zhǎng)情況 術(shù)后7、14和21 d觀察移植皮片存活及生長(zhǎng)情況，計(jì)算術(shù)后21 d的MEEK皮片生長(zhǎng)覆蓋創(chuàng)面面積。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)、單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠創(chuàng)面收縮率比較

A、B、C組術(shù)后7、14和21 d創(chuàng)面收縮率比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面收縮率有差別（F=121.668，P=0.000）；②3組創(chuàng)面收縮率有差別（F=8.685，P=0.002），A組較B組創(chuàng)面收縮率高（P＜0.05），相對(duì)容易收縮；B組與C組的創(chuàng)面收縮率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)（P＞0.05）；③3組創(chuàng)面收縮率變化趨勢(shì)有差別（F=7.408，P=0.000）。見附表和圖3。

2.2 3組大鼠鋼圈脫出及線結(jié)脫落情況

2.2.1 鋼圈脫出 術(shù)后21 d，A組大鼠鋼圈脫出嚴(yán)重，鋼絲脫出總長(zhǎng)度35 cm；B組鋼圈基本保持原位，少量邊角脫出，鋼絲脫出總長(zhǎng)度16 cm；C組情況與B組相似，鋼絲脫出總長(zhǎng)度13 cm。

附表 3組大鼠各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面收縮率比較（n =8，%，±s）

附表 3組大鼠各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面收縮率比較（n =8，%，±s）

A組 11.7±5.8 27.4±4.4 58.2±14.7 B 組 8.5±2.5 27.0±9.2 37.2±8.0

圖3 3組大鼠創(chuàng)面收縮率變化趨勢(shì) （n =8）

2.2.2 線結(jié)脫落 A組線結(jié)大量脫落，剩余線結(jié)（8.4±8.3）個(gè)；B組少許線結(jié)脫落，剩余線結(jié)（17.4±6.1個(gè)），C組剩余線結(jié)（20.0±4.8）個(gè)。3組剩余線結(jié)數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.864，P=0.005）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，A組剩余線結(jié)數(shù)低于B、C組（P＜0.05）；B組與C組剩余線結(jié)數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 3組大鼠移植皮片生長(zhǎng)情況

術(shù)后7 d，A、B組皮片成活（見圖4A、5A）。術(shù)后14 d，A組皮片無明顯生長(zhǎng)，B組皮片生長(zhǎng)良好（見圖4B、5B）。術(shù)后21 d，A組皮片仍無生長(zhǎng)，部分大鼠皮片被咬掉脫落，殘余移植皮片覆蓋創(chuàng)面，面積（1.9±0.5）cm2（見圖4C）；B組移植皮片進(jìn)一步生長(zhǎng)，逐漸覆蓋部分創(chuàng)面，面積（4.5±0.4）cm2（見圖5C），經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.033，P=0.001），B組覆蓋創(chuàng)面面積大于A組。C組為空白對(duì)照，未進(jìn)行植皮，創(chuàng)面呈肉芽組織狀態(tài)（見圖6）。

圖4 A組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)移植皮片生長(zhǎng)情況

圖5 B組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)移植皮片生長(zhǎng)情況

圖6 C組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面修復(fù)情況

3 討論

創(chuàng)傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型常用的動(dòng)物有大鼠、小型豬、兔等[6-7]。大鼠具有體型小、飼養(yǎng)方便、繁殖快、價(jià)格相對(duì)較低等優(yōu)點(diǎn)，因而成為最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。有多種在大鼠背部皮膚復(fù)制全層缺損模型的方法：余剛等[8]提出C形阻隔圈；張穎等[9]應(yīng)用硅膠環(huán)來固定創(chuàng)面；柴政[10]將塑料環(huán)植入大鼠背部皮膚缺損，以復(fù)制慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面模型；王如然等[11]用直接打孔的方式在大鼠背部復(fù)制潰瘍創(chuàng)面，各種方法均有優(yōu)缺點(diǎn)。尚玉茹等[5]利用胸骨鋼絲固定創(chuàng)緣，復(fù)制抗攣縮創(chuàng)面模型。采用移植異體皮覆蓋創(chuàng)面，移植后的異體皮可以在創(chuàng)面存活生長(zhǎng)，存活的異體皮具有占位效應(yīng)，一定程度減小四周創(chuàng)緣的攣縮。3周后異體皮因排異反應(yīng)脫落，創(chuàng)面開始出現(xiàn)明顯攣縮。本實(shí)驗(yàn)基于上述研究結(jié)果，對(duì)創(chuàng)面的復(fù)制過程進(jìn)一步細(xì)化研究。本實(shí)驗(yàn)采用MEEK植皮技術(shù)所移植皮片可以存活，但每個(gè)微型皮片面積較小，皮片間有一定距離。與空白對(duì)照組創(chuàng)面邊緣收縮情況比較，MEEK植皮在術(shù)后3周不會(huì)因?yàn)槠て某苫疃a(chǎn)生占位效應(yīng)，進(jìn)而抑制創(chuàng)緣向中心收縮。術(shù)后1周，3組大鼠創(chuàng)緣四周出現(xiàn)收縮趨勢(shì)，隨時(shí)間推移進(jìn)一步收縮；術(shù)后3周明顯攣縮，A組收縮最嚴(yán)重，B、C組大鼠收縮程度較A組輕。結(jié)果表明，B、C組采用的改良方法對(duì)無異體皮覆蓋的全層損傷創(chuàng)面有提高抗攣縮的效果。

本研究通過改良復(fù)制創(chuàng)面的位置和縫合方法，有效地提高全層皮膚缺損抗攣縮模型的穩(wěn)定性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中大鼠的依從性差，通常會(huì)自咬、自舔創(chuàng)面，改變創(chuàng)面位置可以有效避免此類情況發(fā)生，為創(chuàng)面的生長(zhǎng)消除不利因素。術(shù)后3周，B組皮片生長(zhǎng)情況優(yōu)于A組，表明改良方法有利于植皮修復(fù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。大鼠在自咬打包敷料及縫線時(shí)，可能造成鋼圈脫落。鋼圈脫落有2種方式：脫出體外和脫出線結(jié)但仍在皮下，2種方式脫出的鋼圈均不能發(fā)揮抗攣縮作用。鋼圈脫落的另一種原因是因?yàn)槠つw攣縮而掙脫線結(jié)。更換較粗縫線提高縫線的強(qiáng)度和改變縫合方式，將鋼圈更加牢靠地固定于皮下，能有效避免縫線和鋼圈脫落，起到抗攣縮作用。

復(fù)制合適的大鼠創(chuàng)面模型與植皮修復(fù)創(chuàng)面的療效關(guān)系密切[12]。對(duì)復(fù)制創(chuàng)面模型的細(xì)節(jié)進(jìn)行深入探究，更有利于實(shí)際操作。成熟的復(fù)制動(dòng)物模型技術(shù)可為創(chuàng)面修復(fù)實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行提供便利。