張欣 倪健 郭琳 杜梓萱 王美玲 冷新 游龍?zhí)? 王允亮 李軍祥 尹興斌

摘要：目的??優(yōu)選清腸溫中顆粒中黃連、三七、青黛的最佳醇提工藝。方法??以黃連生物堿、三七皂苷和靛玉紅的提取率為指標(biāo)，采用正交試驗考察乙醇提取工藝，采用單因素試驗考察離心工藝和濃縮干燥工藝。結(jié)果??優(yōu)選的工藝為：黃連、三七、青黛3味藥加10倍量60%乙醇，加熱回流提取3次，每次1.5 h，提取液過濾，濾液5000 r/min離心10 min或7000 r/min離心5 min，所得離心液80 ℃以下減壓回收乙醇，濃縮成相對密度為1.15～1.30（60 ℃）的稠浸膏，50 ℃以下減壓干燥，粉碎成細(xì)粉。結(jié)論??本研究確定的工藝穩(wěn)定性好，合理可行，可為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

關(guān)鍵詞：清腸溫中顆粒;正交試驗;單因素試驗;黃連生物堿;三七皂苷;靛玉紅;提取純化;濃縮干燥

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.10.016

中圖分類號：R283.5 ???文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ???文章編號：1005-5304（2018）10-0073-06

Multi-index?Optimization of Alcohol Extraction Process of Coptidis Rhizoma， Notoginseng Radix et Rhizoma and Indigo Naturalis in Qingchang Wenzhong?Granules

ZHANG Xin^1，2， NI Jian¹， GUO Lin¹， DU Zi-xuan¹， WANG Mei-ling¹， LENG Xin¹， YOU Long-tai¹，WANG Yun-liang³， LI Jun-xiang³， YIN Xing-bin¹

1. School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China;?2. Beijing Union Second Pharmaceutical Factory， Beijing 102600， China; 3. Dongfang Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100078， China

Abstract： Objective?To optimize the alcohol extraction process of Coptidis Rhizoma， Notoginseng Radix et Rhizoma and Indigo Naturalis in Qingchang Wenzhong Granules. Methods?With the extraction rates?of coptis alkaloids，?panax notoginseng saponins and indirubin as indexes， Coptidis Rhizoma， Notoginseng Radix et Rhizoma and Indigo Naturalis adopted orthogonal test to optimize the alcohol extraction process and adopted the single factor test to investigate the centrifugation， concentration and drying process. Results?The optimal process was： Coptidis Rhizoma， Notoginseng Radix et Rhizoma and Indigo Naturalis were extracted with 10 folds of 60% alcohol for 3 times， 1.5 hours for each time. The filtrate was centrifuged by the speed of 5000 r/min for 10 min or 7000 r/min for 5 min. The centrifugal fluid was concentrated to a relative density of 1.15–1.30 （60 ℃） by recycling alcohol below 80 ℃. Followed with the decompression drying below 50 ℃， the dry extract was crushed into fine powder. Conclusion?The process is stable， reasonable and feasible， which can provide a reference for the mass production.

Keywords：Qingchang WenzhongGranules; orthogonal test; single factor test; coptis alkaloids; panax notoginseng saponins; indirubin; extraction and purification; concentration and drying

清腸溫中方為北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院臨床經(jīng)驗方，治療寒熱錯雜型潰瘍性結(jié)腸炎療效顯著。該方由黃連、青黛、三七、苦參等8味藥組成，寒熱平調(diào)，理氣活血，清熱止血，以清腸治其標(biāo)，溫中治其本，能促進(jìn)結(jié)腸黏膜修復(fù)和愈合^[1]，改善患者臨床癥狀^[2]。

本方臨床用藥形式為湯劑，在口服、運輸、貯存等方面有諸多不便。因此，本課題結(jié)合現(xiàn)代中藥制劑工藝技術(shù)，對其制劑工藝進(jìn)行優(yōu)選，擬制成顆粒劑，以提高其方便性和穩(wěn)定性，也為該臨床經(jīng)驗方制備成醫(yī)院制劑或中成藥提供研究基礎(chǔ)。根據(jù)方中各藥味藥理作用和成分的性質(zhì)，設(shè)計黃連、三七、青黛采用乙醇回流提取，其余藥味采用水提醇沉工藝提取。本試驗對黃連、三七、青黛的醇提工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，力求最大程度提取有效成分，保證制劑質(zhì)量和藥效。

1 ?儀器與試藥

FW-200型高速萬能粉碎機(jī)（北京科偉永興儀器有限公司），KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司），ZDHM型調(diào)溫電熱套（北京市中興偉業(yè)儀器有限公司），TDL-5型臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），DZKW-4型電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），DZF-6050型真空干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），JY5002型電子天平（上海衡平儀器儀表廠，0.01 g），CPA225D型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，0.01 mg），RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海振捷實驗設(shè)備有限公司），LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司，SPD-20A DAD檢測器，LC Solution色譜工作站），Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）。

黃連（批號501002642）、三七（批號401003991），北京同仁堂藥材有限責(zé)任公司;青黛（批號1504019），北京琪景飲片廠。表小檗堿對照品（批號H25F3X1），上海源葉生物科技有限公司;黃連堿對照品（批號3022/17817），月旭材料科技（上海）有限公司;鹽酸巴馬汀對照品（批號110732-201510）、鹽酸小檗堿對照品（批號110713-201212）、三七皂苷R1對照品（批號110745-201318）、人參皂苷Rg1對照品（批號110703-201530）、人參皂苷Rb1對照品（批號110704- 201424）、靛玉紅對照品（批號110717-200204），中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇為色譜純，F(xiàn)isher公司;試驗用水為高純水，其他化學(xué)試劑均為分析純。

2 ?方法與結(jié)果

2.1 ?指標(biāo)成分含量測定

2.1.1 ?靛玉紅含量測定

2.1.1.1 ?對照品溶液的制備

取靛玉紅對照品適量，精密稱定，加N，N-二甲基甲酰胺制成每1 mL含0.004 14 mg的溶液，即得。

2.1.1.2 ?供試品溶液的制備

按處方比例稱取飲片適量，加入規(guī)定倍量、規(guī)定濃度的乙醇進(jìn)行加熱回流提取，至規(guī)定時間及次數(shù)，過濾，合并濾液，定容于1000 mL容量瓶中，加相應(yīng)濃度乙醇至刻度，搖勻。精密量取5 mL于10 mL量瓶中，加相應(yīng)濃度乙醇至刻度，搖勻，取少量，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.1.1.3 ?陰性對照溶液的制備

按處方比例稱取除青黛外的飲片，按“2.1.1.2”項下方法制備，即得。

2.1.1.4 ?色譜條件

采用Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（70∶30），柱溫30 ℃，檢測波長292 nm，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖1。

2.1.2 ?三七皂苷含量測定

2.1.2.1 ?對照品溶液的制備

取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL分別含0.108 38、0.431 36、0.421 28 mg的混合對照品溶液，即得。

2.1.2.2 ?供試品溶液的制備

同“2.1.1.2”項。

2.1.2.3 ?陰性對照溶液的制備

按處方比例稱取除三七外的飲片，按“2.1.2.2”項下方法制備，即得。

2.1.2.4 ?色譜條件

采用Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～60 min，18%A;65～75 min，28%A;95～100 min，32%～95%A;105～135 min，18%A）;流速：1.0 mL/min;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：對照品溶液5 μL，供試品溶液10 μL。色譜圖見圖2。

2.1.3 ?黃連生物堿含量測定

2.1.3.1 ?對照品溶液的制備

取表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL分別含0.021 44、0.040 80、0.020 07、0.080 93 mg的混合對照品溶液，即得。

2.1.3.2 ?供試品溶液的制備

除“精密量取5 mL于25 mL量瓶中”外，其他操作同“2.1.1.2”項。

2.1.3.3 ?陰性對照溶液的制備

按處方比例稱取除黃連外的飲片，按“2.1.3.2”項下方法制備，即得。

2.1.3.4 ?色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相：乙腈∶0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液=50∶50（每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0）;流速：1.0 mL/min;進(jìn)樣量：10 μL。色譜圖見圖3。

2.2 ?乙醇回流提取工藝考察

2.2.1 ?三七粒度考察

因三七質(zhì)地堅硬，不易煎煮，故對三七的粉碎粒度進(jìn)行考察。取三七藥粉（最粗粉、粗粉、中粉各2份）12 g，加60%乙醇回流提取3次，每次1.5 h（每次加300 mL），提取液過濾，放冷，轉(zhuǎn)移至1000 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻。精密量取5 mL至10 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，測定三七皂苷含量。結(jié)果不同粉碎粒度三七中三七皂苷含量為：粗粉>最粗粉≈中粉。粗粉與其他兩者相比，提取量無明顯提高，見表1。因此，考慮到最粗粉較粗粉來說，煎煮時不易糊化，且過濾相對較易，確定三七在提取時選擇粉碎成最粗粉（過1號篩）。

2.2.2 ?單因素試驗考察醇提濃度

按處方比例稱取青黛、三七、黃連飲片4份，每份30 g，固定提取次數(shù)為2次，每次溶劑量為12倍量，每次提取時間為2 h，分別采用50%、60%、70%、80%乙醇進(jìn)行提取，考察不同乙醇濃度對指標(biāo)成分提取率的影響，確定合適的醇提濃度。結(jié)果乙醇濃度越高，靛玉紅提取率越大，乙醇濃度為60%、70%時，靛玉紅提取率已達(dá)到80%以上;乙醇濃度在60%、70%、80%時，對三七和黃連的提取率影響不大（見表2）。綜合3個指標(biāo)，考慮到大生產(chǎn)低能高效的要求，確定提取溶劑為60%乙醇。

2.2.3 ?醇提工藝正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，固定提取溶劑為60%乙醇，選取提取次數(shù)（A）、提取時間（B）、溶劑倍量（C）為影響因素，每個因素設(shè)3個水平，采用L₉（3⁴）正交試驗設(shè)計，優(yōu)選最佳醇提工藝，因素水平見表3。按處方比例稱取黃連、三七、青黛飲片共9份，每份30 g，按表3安排進(jìn)行試驗。采用SAS8.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，直觀分析結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5～表7。

從直觀分析可以看出，3個指標(biāo)的最佳工藝均為A₃B₃C₃。根據(jù)方差分析結(jié)果，僅A因素對靛玉紅提取率有顯著影響（P<0.05），各因素對三七皂苷提取率均無顯著影響（P>0.05），各因素對黃連生物堿提取率均有顯著影響（P<0.05），A因素3個水平之間的差異較大，B因素的差異主要在B₁與B₂、B₃之間，C因素的差異主要在C₁與C₂、C₃之間，故B因素選擇B₂水平，C因素選擇C₂水平。優(yōu)選的醇提工藝條件為A₃B₂C₂，即加60%乙醇加熱回流提取3次，每次1.5 h，每次加10倍量溶劑。

2.2.4 ?醇提工藝驗證試驗

按處方比例稱取3份飲片，每份含黃連、三七、青黛共30 g，按優(yōu)選工藝A₃B₂C₂進(jìn)行驗證試驗，結(jié)果見表8?？梢?，優(yōu)選的工藝重復(fù)性好，穩(wěn)定可行。

2.3 ?純化工藝考察

醇提藥物中，青黛為極細(xì)粉，可過200目篩，普通的過濾裝置無法將其除去，影響后續(xù)成型工藝顆粒的溶化性，故需對離心工藝進(jìn)行考察。

2.3.1 ?離心轉(zhuǎn)速考察

按處方比例稱取三七、黃連、青黛共30 g，按優(yōu)選工藝A₃B₂C₂進(jìn)行提取，精密移取提取液4份，每份100 mL，分別于3000、5000、7000、9000 r/min離心10 min，優(yōu)選最佳的離心轉(zhuǎn)速，結(jié)果見表9。在所考察的轉(zhuǎn)速條件下，指標(biāo)成分含量幾乎無損失，結(jié)合濾紙截留殘渣及沉淀緊實情況，確定離心10 min，轉(zhuǎn)速在5000 r/min以上均可達(dá)到固液分離要求。

2.3.2 ?離心時間考察

考察5000 r/min和7000 r/min轉(zhuǎn)速條件下不同離心時間的影響，結(jié)果見表10。離心時間對指標(biāo)成分的含量影響不大，結(jié)合濾紙上截留殘渣及沉淀緊實情況，建議選用的離心參數(shù)為5000 r/min離心10 min或7000 r/min離心5 min。

2.4 ?濃縮干燥工藝考察

2.4.1 ?濃縮溫度考察

按處方比例稱取三七、黃連、青黛共720 g，按優(yōu)選的提取工藝和離心工藝制得離心液，攪拌均勻。精密量取離心液1000 mL共3份，分別于60、70、80 ℃條件下減壓濃縮成相對密度為1.15～1.20（60 ℃）的藥液，放冷，加60%乙醇復(fù)溶至1000 mL，玻璃棒攪拌均勻。精密量取5 mL至10 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，測定靛玉紅和三七皂苷含量;精密量取5 mL至25 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，測定黃連生物堿含量。計算不同溫度濃縮前后各指標(biāo)成分的損失率，結(jié)果見表11。不同溫度條件下減壓濃縮，各成分損失率約為4%～6%，濃縮溫度在60～80 ℃均可。

2.4.2 ?濃縮相對密度考察

按處方比例稱取三七、黃連、青黛共720 g，按優(yōu)選的提取工藝和離心工藝制得離心液，攪拌均勻。精密量取離心液3000 mL共3份，分別于80 ℃減壓濃縮成相對密度為1.15～1.20（60 ℃）、1.20～1.25（60 ℃）、1.25～1.30（60 ℃）的藥液，放冷，加60%乙醇復(fù)溶至3000 mL，用玻璃棒攪拌均勻。精密量取5 mL至10 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，測定靛玉紅和三七皂苷含量;精密量取5 mL至25 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，測定黃連生物堿含量。計算不同相對密度條件下各指標(biāo)成分的損失率，結(jié)果見表12。藥液濃縮至不同相對密度后，指標(biāo)成分的保留率均在90%以上。因此，藥液減壓濃縮至相對密度1.15～1.30（60 ℃）均可。

2.4.3 ?干燥溫度考察

按處方比例稱取三七、黃連、青黛共720 g，按優(yōu)選的提取工藝和離心工藝進(jìn)行試驗，將所得離心液濃縮成相對密度為1.25～1.30（60 ℃）的藥液。稱取藥液4份，每份約30 g，分別于50、60、70、80 ℃條件下減壓干燥（-0.06～-0.1 MPa），得干浸膏。干浸膏加60%乙醇復(fù)溶至3000 mL，用玻璃棒攪拌均勻。精密量取5 mL至10 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，測定靛玉紅和三七皂苷含量;精密量取5 mL至25 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，測定黃連生物堿含量。計算不同溫度下干燥前后各指標(biāo)成分的損失率，結(jié)果見表13。對于靛玉紅，干燥溫度為50 ℃時成分無損失，60～80 ℃時損失率高達(dá)50%以上;對于三七皂苷，4個溫度條件下?lián)p失均較低;對于黃連生物堿，50～70 ℃時損失率較低，80 ℃時損失達(dá)20%以上。綜合3個指標(biāo)，確定溫度在50 ℃時對3個指標(biāo)成分都有較好的保留。

3 ?討論

現(xiàn)代研究表明，黃連生物堿、三七皂苷和靛玉紅具有很好的抗炎、抗病毒、抗腫瘤作用^[3-6]。本研究以其為指標(biāo)成分，符合中藥復(fù)方多成分、多指標(biāo)評價思路，客觀反映了提取工藝的優(yōu)劣。在綜合評價時，由于加權(quán)方法容易加強(qiáng)或抵消某些成分的貢獻(xiàn)作用，故未選用多指標(biāo)加權(quán)方法，而采用直觀比較方法。

2015年版《中華人民共和國藥典》載，青黛“1～3 g，宜入丸散用，外用適量”^[7]。閔志強(qiáng)等^[8]對青黛不宜入湯劑進(jìn)行了考證，認(rèn)為青黛易浮于水面、有效成分難以溶出、影響其他藥味成分煎出、過濾困難等。且清腸溫中方青黛日用量為3 g，沖服時對咽喉刺激性強(qiáng)。本研究嘗試尋找既利于有效成分提取又經(jīng)濟(jì)省時的方法。有研究表明，使用含羥基的潤濕劑乙醇可增大青黛中靛玉紅的溶出度，將青黛與黃連一起乙醇回流提取，靛玉紅的提取率均較高^[9-11]。故確定青黛與黃連、三七三者一起進(jìn)行乙醇回流提取。

為了除去提取過程中普通過濾難以除去的青黛細(xì)粉，本試驗對離心工藝進(jìn)行了考察。為安全起見，待離心藥液的乙醇含量不宜太高。本試驗醇提部分藥液乙醇濃度在60%左右，不宜直接離心，故需對醇提液適當(dāng)濃縮以降低乙醇含量，有待后續(xù)研究。

本試驗考察了50、60、70、80 ℃的干燥效果，50 ℃時干燥最慢但指標(biāo)成分基本無損失，60、70、80 ℃干燥時間較短，但靛玉紅損失率約為50%。徐德然等^[12]研究了板藍(lán)根提取純化及濃縮干燥工藝，結(jié)果靛玉紅60 ℃比40 ℃損失了約20%，80 ℃比40 ℃損失了近50%，認(rèn)為濃縮體積和干燥溫度對靛玉紅含量有顯著影響。筆者認(rèn)為，靛玉紅在干燥過程中的損失不僅受溫度影響，也受浸膏體積、真空度影響，這些因素又影響了干燥時間，是各因素綜合作用的結(jié)果。理論上，靛玉紅含量在50～60 ℃應(yīng)出現(xiàn)逐漸減少的趨勢，因本試驗選擇間隔溫度點進(jìn)行考察，故未能得到相應(yīng)數(shù)據(jù)。鑒于此，對于受溫度影響較大的成分，在進(jìn)行干燥處理時，必須將干燥體積和干燥時間等因素考慮在內(nèi)，才能得出更加可靠的結(jié)論。

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