王 虹，劉 鑫，鄒曉霜，李佳妮，王 歡，齊寶坤，王中江，江連洲

(1黑龍江珍選食品有限公司，哈爾濱 150060；2東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，哈爾濱 150030)

風味肽具有加工性良好、易被消化吸收，并兼具有某些特定生理活性等諸多優(yōu)點，其中鮮味肽在保有其他味覺條件不被破壞的情況下，還可提升各自的呈味風味，所以鮮味肽在菜、乳、肉等食材增味方面具有突出效果[1-3]。目前，我國研制的復合調(diào)料存在食用品質(zhì)差、風味失真等缺陷[4]。本試驗利用定向分段酶解技術酶解鮮味原料底物，即沙丁魚及對蝦[5]，經(jīng)前階段試驗已探究出復合蛋白酶初步酶解最優(yōu)工藝，即復合蛋白酶加酶量3.3%、溫度57℃、酶解時間3.5h、pH7.1，將蛋白較充分地水解成肽片段，結構更為松散后，再加入風味復合酶實現(xiàn)第二階段的酶解[6]，如此可在保證傳統(tǒng)鮮味的同時，提高蛋白質(zhì)得率，便于人體吸收。采用單因素試驗及響應面法，以優(yōu)化風味蛋白酶添加量、酶解時間、溫度及pH等工藝，最終確定定向分段酶解條件，并以對蝦及沙丁魚水解液為原料與其他調(diào)味原料復配，開發(fā)新型海鮮調(diào)味料[7]，為研發(fā)新型高鮮、高香以及高營養(yǎng)特性的海鮮復合調(diào)味品開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1材料 對蝦、沙丁魚，市售；復合蛋白酶，諾維信(中國)投資有限公司；濃硫酸、硼酸 、TCA、NaOH、CuSO4·5H2O、K2SO4、甲基紅、溴甲酚綠，上海凌峰化學試劑有限公司；酶解液、葡萄糖、白砂糖、食鹽、醬油、海藻酸鈉、淀粉、生姜粉，均為食品級。

1.1.2儀器與設備 Mettler Toledo分析天平，上海衡平有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海一恒有限公司；F-4500型熒光分光光度計，日本Hitachi公司；GL-25MS 超速高速冷凍離心機，上海盛析儀器設備有限公司；超濾裝置，無錫賽普膜科技發(fā)展有限公司；KND2C型定氮儀，上海纖撿儀器有限公司；數(shù)顯臺式酸度計，上海浦春計量儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥儀，上海亞榮有限公司；PF6原子熒光儀、TSA-986 原子吸收儀，北京普析有限公司；FDU-1200冷凍干燥機，日本東京Rikakikai公司；L-8900氨基酸分析儀，日本日立高科技有限公司；Mersham蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)，美國曼德公司；Superdex peptide 10/300 GL分析柱，美國上海諾磁公司。

1.2 試驗方法

1.2.1酶解提肽方法 前期階段添加復合蛋白酶酶解[8]，將蛋白顆粒先被水解為肽片段，酶解條件：復合蛋白酶加酶量3.3%、溫度57℃、酶解時間3.5h、pH7.1。結構松散后，離心得上清液，再加入風味復合酶實現(xiàn)第二階段的酶解，去除苦味肽，離心后取上清液即為酶解成品。分段酶解技術不僅提高多肽得率，同時增加氨基酸含量，使鮮味更加濃郁。

1.2.2酶解工藝流程[9-10]原料→解凍→粉碎→蝦魚漿→混合液→復合蛋白酶水解→滅酶→離心→過濾→取上清液→風味蛋白酶水解→滅酶→離心→過濾→取上清液→成品

1.2.3基本指標測定 總氮量依據(jù)GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》方法測定[11]，氨基態(tài)氮含量根據(jù)ZBX 66038—1987《基態(tài)氮測定法》方法進行測定[12]。水解度的測定如式(1)所示，用以表征底物蛋白中被水解肽鍵數(shù)占肽鍵總數(shù)的百分含量[13]。

(1)

1.2.4響應面試驗設計 針對采用風味酶對鮮味肽進行二次酶解試驗中，以各酶解工藝參數(shù)酶解溫度x1(℃)、酶解pH x2、酶解時間x3(h)、酶添加量x4(%)作自變量，鮮味肽水解率作響應值(表1)。

表1 因素水平編碼

1.2.5酶解液多肽分子量分布 取離心后酶解液上清液，通過Amersham 蛋白純化系統(tǒng)，Superdex peptide 10/300 GL分析柱，在洗脫液0.25 mol/L氯化鈉、0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液、pH 7.2、進樣體積50 μL、檢測波長214 nm、流速0.5 mL/min條件下[14]，進行酶解液多肽分子量分布測定。

1.2.6酶解液氨基酸分析[15]將定量樣品移至水解管內(nèi)，添加6 mol/L HCl，抽真空后并封管。于水解器中在110°C條件下水解24h。定容后進行過濾操作，對所得濾液加以干燥使其成固態(tài)，隨后試樣溶解于0.02 mol/L HCl并調(diào)整至適合的濃度，使用氨基酸分析儀進行氨基酸類型及組成成分測定[16-17]。

1.2.7酶解液美拉德反應 取分子量不同的酶解組分樣品1.5 g，依次添加1.5 g葡萄糖、0.3 g食用姜粉、0.3 g NaCl、蒸餾水10 mL，加溫至115°C后加熱0.5h以開始美拉德反應，反應結束停止后即刻冷卻樣品至室溫。隨后用蒸餾水將反應溶液稀釋到適宜濃度，留待感官評價[18]。

1.2.8調(diào)味料配方[19]以酶解濃縮液為基料，添加白砂糖、食鹽、味精、淀粉(食品級)等輔料制備混合調(diào)味料。

1.2.9數(shù)據(jù)分析 每組試驗重復3次，試驗數(shù)據(jù)使用SigmaPlot 12.5軟件繪制趨勢曲線圖。

2 結果與分析

2.1 風味蛋白酶酶解條件確定

通過單因素試驗對風味蛋白酶的時間、酶添加量、pH及酶解溫度等工藝條件進行優(yōu)化，以確定風味蛋白酶酶解的最適工藝參數(shù)。

2.1.1風味蛋白酶酶解單因素試驗

(1)加酶量對酶解效果的影響：由圖1可知，pH調(diào)整至7、酶解時間1 h、酶解溫度50°C時，水解度的變化趨勢為先升高后降低。加酶量為1%時水解度最高。(2)酶解時間對酶解效果的影響：由圖2可知，pH調(diào)整至7、酶添加量1%、酶解溫度50℃時，水解度的變化趨勢為先上升后下降。時間為2 h時水解度最高。(3)pH對酶解效果的影響：由圖3可知，在酶解溫度50℃、酶解時間1h、酶添加量1%，水解度的變化趨勢為先上升后下降。pH為7時水解度最高。(4)溫度對酶解效果影響：由圖4可知，調(diào)整pH至7、酶解時間1 h、酶添加量1%，水解度的變化趨勢呈先上升后下降。其中，酶解溫度50°C時蛋白水解程度最大。

圖1 加酶量對酶解效果的影響

圖2 酶解時間對酶解效果的影響

圖3 pH對酶解效果的影響

圖4 溫度對酶解效果影響

2.1.2風味蛋白酶酶解響應面試驗結果

(1)風味蛋白酶酶解鮮味肽響應面試驗：以單因素試驗為基礎，依照Box-Behnken響應面法的試驗要求，開展多組試驗(表2)。采用Design Expert軟件分析，將溫度、pH、酶解時間及酶添加量作響應變量，以水解率作響應值進行回歸分析，得到預測模型如式(2)：

Y=63.51+1.85X1+2.46X2-2.76X3-3.68X4+4.98X1X2+0.50X1X3-0.22X1X4+1.92X2X3+2.81X2X4-3.08X3X4-5.39 X12-5.75X22-2.54X32-5.27X42

(2)

表2 響應方案及結果

表3 回歸與方差分析結果

(2)因素間的交互作用：根據(jù)表3可得，交互項x1×x2對鮮味肽水解率影響極顯著，重點分析交互項AB對水解度(Y)的影響，固定模型中的酶解時間x3=2h和加酶量x4=1%，x1×x2交互作用的三維曲面圖與等高線圖見圖5。

圖5 交互項x1×x2對水解度的影響

2.2 酶解液成分的測定

2.2.1酶解液中多肽分子量分布的測定結果 由圖6～7可見，一次酶解液中多肽主要集中在3 000～5 000 Da以上，占到44.15%，大于10 000 Da肽段的比例最低，為4.67%。相比一次酶解液，二次酶解液中分子量大于5 000Da的肽段比例顯著降低，1 000～3 000 Da肽段比例最大，可見，通過二次酶解能較好地降解大分子量的片斷。酶解液通過二次酶解后，產(chǎn)物中分子量小于5 000 Da 的肽段比例顯著提高，酶解產(chǎn)物中肽段分子量主要分布在1 000～3 000 Da及3 000～5 000 Da這兩部分，占總肽段的比例為88.2%。

綜上所述，通過復合酶水解能較好地降解海鮮中分子量大于10 000 Da的片斷，酶解產(chǎn)物中分子量主要分布在3 000～5 000 Da，而經(jīng)過風味蛋白酶進行二次酶解后，其中分子量大多分布于1 000～3 000 Da內(nèi)。目前研究人員分離得到的鮮味肽也主要是分子量介于3 000Da以下的寡肽，可見，兩次酶解液的肽分子量分布特點證明，二次酶解有助于酶解更加充分，使大分子量的肽分解成寡肽的轉(zhuǎn)化率更高，更有助于鮮味的體現(xiàn)。

圖6 一次酶解液的肽分子量分布

圖7 二次酶解液的肽分子量分布

2.2.2最佳條件下酶水解液中氨基酸的含量測定

(1)復合蛋白酶水解液中氨基酸的含量：以復合蛋白酶酶解后樣品中氨基酸量為參照，以其中氨基酸含量對后續(xù)試驗中風味酶解對氨基酸的影響進行比對考察(表4)。(2)復合蛋白酶與風味蛋白酶分段酶解液中氨基酸含量：比對表4，參照表5可知，雙酶水解后的水解液中，各種氨基酸的含量均有較顯著提升。大量氨基酸是進行美拉德反應的先決條件，可見雙酶解試驗后不但能改善產(chǎn)品風味，還能大量提取初次水解液中的氨基酸，試驗效果十分顯著。

表4 復合蛋白酶解液中各種氨基酸的含量

表5 分段酶解液中各種氨基酸的含量

2.2.3美拉德驗證風味試驗 通過初次水解液及風味酶二次水解液的美拉德反應，判斷對比其最終風味。從表7可以看出，單一酶水解得到的水解液經(jīng)美拉德反應后烤魚味一般，呈現(xiàn)苦腥味；而經(jīng)復合及風味蛋白酶二次水解后的水解液感官上均好過僅經(jīng)單一酶水解的樣品，故經(jīng)復合蛋白酶及風味蛋白酶二次水解是必要的。

表6 美拉德反應感官評定

2.2.4調(diào)味料的制備 以酶解液為基料，按照以下配方進行調(diào)配：酶解液100 mL、白糖8 g、食鹽4 g、醬油14 mL、淀粉7.5 g、海藻酸鈉0.05 g、姜汁3 mL、香油2 mL，加熱濃縮至一定稠度后即可制備出具有海鮮風味的復合調(diào)味料。該產(chǎn)品呈半流體狀、味道鮮美、口感天然，具有海產(chǎn)品特有香氣，其產(chǎn)品質(zhì)量指標見表7。

表7 復合調(diào)味料質(zhì)量指標

3 結論

試驗選擇對蝦及沙丁魚作原材料，利用復合蛋白酶及風味蛋白酶雙酶定向分段酶解手段生產(chǎn)高附加值鮮味提升肽，充分實現(xiàn)了對水產(chǎn)資源的高效利用。在采用復合蛋白酶初步水解基礎上，確定風味蛋白酶二次酶解生產(chǎn)鮮味肽的最佳工藝參數(shù)：溫度51℃、pH 7.1、酶解時間1.9h、酶添加量1.0%，該條件下實現(xiàn)的雙酶解工藝使得水解率高達64.24%。相較于初次酶解，風味酶的二次水解能夠顯著提升酶解液內(nèi)氨基酸含量，且二次水解液經(jīng)美拉德反應后質(zhì)量也明顯優(yōu)于初次水解液。以二次水解液為基料開發(fā)海鮮調(diào)味料，產(chǎn)品風味宜人，工藝簡便且不需添加味精或其他鮮味劑，口味自然，具有較樂觀的開發(fā)前景及市場預期?！?/p>