錢夢(mèng)溪 張?jiān)伱?亢 振 錢 偉 余 輝 李建芬

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)埣腋坩t(yī)院藥學(xué)部江蘇省企業(yè)研究生工作站，江蘇張家港 215600；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 江蘇省常州市武進(jìn)中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，江蘇武進(jìn) 213161

胃炎靈顆粒作為南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)埣腋坩t(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）的院內(nèi)制劑，全方由多味中藥組成，如白芍、黃連、赤芍、甘草等[1]，具有疏散肝氣郁結(jié)、清瀉肝熱、解除痙攣、抑制疼痛的功效，用于治療肝氣犯胃引起的急慢性胃炎等癥，臨床應(yīng)用效果良好。方中黃芪是臨床上廣泛應(yīng)用的中藥，具有抗炎作用[2]；黃連清熱燥濕、瀉火解毒，具有抗炎[3]、抑菌等藥理作用[4-6]；甘草具有調(diào)和藥性、解毒等功效，其具有抗炎、抗菌、抗腫瘤的作用[7-9]；白芍具有平肝止痛、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗等功效，其抗炎作用、止痛作用被廣泛應(yīng)用[10-11]；梔子瀉火除煩、清熱利濕，研究表明梔子有抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛等作用[12-13]。

為提高醫(yī)院制劑的質(zhì)量，本研究對(duì)胃炎靈顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立進(jìn)行了研究。采用薄層色譜（TLC）法鑒別顆粒中的黃芪、黃連、甘草，用高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定芍藥苷和梔子苷的含量，結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為胃炎靈顆粒質(zhì)量控制依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀；Waters 2998二極管陣列檢測(cè)器；Empower2色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；AG135型電子天平（瑞士梅特勒公司）。

1.2 試藥

黃芪甲苷（批號(hào)：110718-201415）、黃芪對(duì)照藥材（批號(hào)：120974-201311）、甘草對(duì)照藥材（批號(hào)：120904-201016）、黃連對(duì)照藥材（批號(hào)：120913-201008）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；芍藥苷（批號(hào)：PRF7040 741）、梔子苷（批號(hào)：PRF7051711）均購(gòu)自成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司。以上對(duì)照品純度均＞98%。硅膠板試劑G（批號(hào)：20170314）由青島海洋化工廠分廠生產(chǎn)；甲醇等試劑為色譜級(jí)；胃炎靈顆粒劑由我院制劑室生產(chǎn)（批號(hào)：170104、170111、170118）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 黃芪的鑒別 精密稱定黃芪甲苷對(duì)照品5.07 mg，置于體積為5 mL的容量瓶中，加甲醇定容成每1 mL含黃芪甲苷1.014 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。稱取黃芪對(duì)照藥材5 g，加甲醇30 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液加于中性氧化鋁柱上，用40%甲醇100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗滌2次，每次20 mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状?.5 mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。分別稱取胃炎靈顆粒和無(wú)黃芪的胃炎靈顆粒各10 g，用與黃芪對(duì)照藥材溶液相同的配制方法，配制得供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液。照薄層色譜法《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502試驗(yàn)，吸取上述溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同的棕褐色斑點(diǎn)（圖中箭頭所示）；紫外光燈（365 nm）下顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)（圖中箭頭所示）。觀察到供試品和對(duì)照品斑點(diǎn)一致，顯色相同，陰性對(duì)照無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

2.1.2 甘草的鑒別 稱取對(duì)照藥材1 g，粉碎，加乙醇30 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用乙醚振搖提取2次，每次30 mL，棄去乙醚液，水層用正丁醇振搖提取2次，每次30 mL。分取正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，搖勻，作為對(duì)照藥材溶液。分別稱取胃炎靈顆粒和無(wú)甘草的胃炎靈顆粒各10 g，用與甘草對(duì)照藥材溶液相同的配制方法，配制得供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液。照薄層色譜法《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光和紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同的顏色斑點(diǎn)（圖中箭頭所示）；紫外燈下顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)（圖中箭頭所示）。見(jiàn)圖2。

圖1 黃芪薄層色譜鑒別圖

圖2 甘草薄層色譜鑒別圖

2.1.3 黃連的鑒別 取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取黃連對(duì)照藥材0.25 g，加甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，取濾液作為對(duì)照藥材溶液。分別稱取胃炎靈顆粒和無(wú)黃連的胃炎靈顆粒各10 g，用與黃連對(duì)照藥材溶液相同的配制方法，配制得供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液。照薄層色譜法《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502試驗(yàn)，吸取上述溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺（6∶7∶2∶3∶1∶2）為展開(kāi)劑，置于濃氨試液預(yù)飽和20 min的展開(kāi)缸內(nèi)，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)（圖中箭頭所示）；對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)（圖中箭頭所示）。陰性對(duì)照沒(méi)有明顯干擾。見(jiàn)圖3。

圖3 黃連薄層色譜紫外鑒別圖

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇-水（20∶80）為流動(dòng)相，流速 1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為 235 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣 10 μL；理論塔板數(shù)以梔子苷、芍藥苷計(jì)均＞2000。

2.2.2 溶液的制備 對(duì)照品溶液：精密稱取芍藥苷、梔子苷對(duì)照品10.32、10.30 mg，分別置于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解稀釋至刻度，得母液。精密吸取各對(duì)照品母液2.5 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度線，即得芍藥苷、梔子苷濃度分別為0.516、0.515 mg/mL的混標(biāo)溶液。供試品溶液：稱取胃炎靈顆粒30 g，加入甲醇溶解并超聲30 min，先用濾紙過(guò)濾，再將濾液用微孔濾膜過(guò)濾，將續(xù)濾液密封保存作為供試品溶液。陰性溶液：按照胃炎靈顆粒處方組成與制備工藝，分別制備缺梔子及白芍、缺梔子、缺白芍的陰性樣品，按供試品溶液的方法配制成陰性對(duì)照液，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 系統(tǒng)適用性考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。色譜圖見(jiàn)圖4～5。結(jié)果顯示，供試品色譜在與對(duì)照品色譜相應(yīng)保留時(shí)間，有相應(yīng)色譜峰，且分離度良好。

2.2.4 專屬性試驗(yàn) 精密吸取10 μL陰性對(duì)照液，在與樣品測(cè)定方法完全相同的條件下，重復(fù)進(jìn)樣2次，色譜圖見(jiàn)圖6～8，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照無(wú)干擾，提示胃炎靈顆粒中梔子苷、芍藥苷的專屬性較強(qiáng)。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取混標(biāo)溶液20、10、8、6、4、2 μL進(jìn)樣，依法測(cè)定，以各對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），相應(yīng)的對(duì)照品峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸得到回歸方程。梔子苷：y=1 589 692.27x+77 882.44（r=0.9998），芍藥苷：y=1 173 589.99x+16 648.76（r=0.9997）。 結(jié)果表明，梔子苷在 1.030～10.300 μg、芍藥苷在 1.032～10.320 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 吸取同一混標(biāo)溶液，按“2.2.1”條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各成分保留時(shí)間和色譜峰面積。梔子苷、芍藥苷峰面積的RSD分別為1.83%、1.67%。結(jié)果表明儀器的精密度良好，符合含量測(cè)定要求。

圖4 對(duì)照品高效液相色譜圖

圖5 供試品高效液相色譜圖

圖6 缺白芍陰性高效液相色譜圖

圖7 缺梔子陰性高效液相色譜圖

圖8 陰性對(duì)照高效液相色譜圖

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為170111的胃炎靈顆粒，按照“2.2.2”方法制備供試品溶液。取供試品溶液，室溫下放置，分別于 0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示供試品溶液中梔子苷和芍藥苷在12 h內(nèi)峰面積的RSD分別為2.41%、2.63%，以上結(jié)果表明，所制備的供試品溶液中指標(biāo)性成分在12 h內(nèi)穩(wěn)定，符合法定要求。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為170111的胃炎靈顆粒，按“2.2.2”方法制得供試品溶液，平行6份，測(cè)定樣品中指標(biāo)性成分梔子苷、芍藥苷的含量，結(jié)果顯示，兩種成分的平均含量分別為0.9142、0.7293 mg/g，RSD值分別為1.68%、2.41%，表明兩種成分在該測(cè)定條件下，重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取批號(hào)為170111的胃炎靈顆粒1.5 g，共9份，置于錐形瓶中，分別加入一定量的梔子苷和芍藥苷對(duì)照品，按“2.2.2”方法制得供試品溶液，測(cè)定梔子苷和芍藥苷的含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果顯示梔子苷和芍藥苷平均加樣回收率分別為98.92%、97.75%。RSD分別為1.39%、1.19%。見(jiàn)表1。

2.3 樣品測(cè)定

取不同批號(hào)的胃炎靈顆粒，按供試品制備方法處理后測(cè)定，計(jì)算每克顆粒中梔子苷和芍藥苷的含量。見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相的優(yōu)選

為保證各指標(biāo)成分的測(cè)定有較高靈敏度，應(yīng)該選擇合適的紫外吸收波長(zhǎng)，有研究記載用HPLC法測(cè)定芍藥苷含量時(shí)選擇230 nm[14-16]，而梔子苷的最大吸收波長(zhǎng)在238 nm處，經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終選擇235 nm的檢測(cè)波長(zhǎng)，出峰良好。

同時(shí)本研究流動(dòng)相分別選用了乙腈-0.2%磷酸水梯度洗脫、乙腈-1%醋酸溶液（13∶87）、甲醇-水（20∶80）等條件[17-19]，得到色譜峰分離度均良好，但考慮到方法簡(jiǎn)便，且實(shí)驗(yàn)后色譜柱易清洗，最終選擇甲醇-水（20∶80）為流動(dòng)相。

表1 梔子苷、芍藥苷的加樣回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果（n=9）

表2 含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=3）

3.2 小結(jié)

中藥制劑有效成分種類繁多，各成分之間難免相互影響，本試驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定胃炎靈顆粒中兩種有效成分的含量，避免了單一測(cè)定一種有效成分時(shí)另一種有效成分的影響，從而使試驗(yàn)結(jié)果更加接近實(shí)際[20-23]。在235 nm波長(zhǎng)下觀察到兩種有效成分出峰狀況良好，可作為胃炎靈顆粒中芍藥苷和梔子苷的含量測(cè)定方法；TLC的色譜斑點(diǎn)清晰，分離效果良好[24-26]，為胃炎靈顆粒的質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供了參考方法和依據(jù)。