車宏偉 楊海寧 王登才 鄭穩(wěn)生

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所藥物傳輸技術(shù)及新型制劑北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050

疏清處方是以經(jīng)典名方“白虎湯”為基礎(chǔ)加減而長(zhǎng)期應(yīng)用的方劑，由生石膏、大青葉、桑葉、蘆根、甘草組成，具有清熱解毒、宣泄?jié)櫡蔚裙π1-2]，臨床用于小兒外感風(fēng)熱、上呼吸道感染等療效顯著，但因疏清顆粒開(kāi)發(fā)較早，制備工藝落后，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)較低，難以控制藥品質(zhì)量。本研究通過(guò)定性、定量法對(duì)疏清顆粒質(zhì)量進(jìn)行全面考察，以期提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為藥品生產(chǎn)檢驗(yàn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BSA423S-CW分析天平；SHB-Ⅲ循環(huán)水泵；HH-S恒溫水浴鍋；DTC-27超聲儀；硅膠G、GF254薄層板；ZF-C三用紫外分析儀；日立chromaster 5430液相；DAD檢測(cè)器。

1.2 試藥

大青葉（批號(hào)：121367-201403）、甘草（批號(hào)：120925-201109）、蘆根（批號(hào)：121107-201505）、桑葉（批號(hào)：121123-201305）、靛玉紅（批號(hào)：110717-200204）購(gòu)買于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甘草酸單銨鹽（上海古朵生物科技有限公司，批號(hào)：X4860010）；甘草苷（上海古朵生物科技有限公司，批號(hào)：C21H2209）；疏清顆粒（吉林華康藥業(yè)，批號(hào)：20171213、20171230、20180305）；娃哈哈純凈水；鹽酸；高效液相色譜（HPLC）甲醇（Fisher），其他試劑均為分析級(jí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜（TLC）鑒別

2.1.1 桑葉 取本品各3 g，研磨，加三氯甲烷-甲醇（2∶3）50 mL，超聲30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取桑葉對(duì)照藥材2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。除去桑葉，模擬處方，采用完全相同方法制備陰性對(duì)照液。照2015年版 《中國(guó)藥典（四部）》通則 0502[3]試驗(yàn)，吸取上述 3 種溶液各 4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-三氯甲烷-丙酮（4.8∶5.5∶1.1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。 噴以3%氫氧化鈉溶液，置紫外光燈（365 nm）下檢視[4]。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)（圖中箭頭所示）。陰性對(duì)照色譜相應(yīng)的位置上，未見(jiàn)任何斑點(diǎn)，表明該鑒別專屬性強(qiáng)，具較好的重現(xiàn)性。見(jiàn)圖1。

圖1 桑葉薄層色譜圖譜

2.1.2 甘草 取本品各5 g，加甲醇50 mL，超聲30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，置分液漏斗中，用水飽和正丁醇萃取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，再以1%氫氧化鈉溶液萃取2次[5]，每次20 mL，合并堿液，用鹽酸調(diào)pH值至中性，用水飽和正丁醇萃取2次，每次25 mL，合并正丁醇液，以20 mL水洗滌，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状?.5 mL使溶解，作為供試品溶液。另取甘草對(duì)照藥材1 g，加乙醚 40 mL[6]，回流 1 h，濾過(guò)，藥渣加甲醇 30 mL，回流1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用水飽和正丁醇萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇溶液，用水洗滌3次，每次10 mL，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。取甘草苷，加甲醇制成1 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。除去甘草，模擬處方，采用完全相同的方法制備陰性溶液，吸取上述4種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一GF254薄層板上，用乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）作為展開(kāi)劑[7-8]，展開(kāi)，取出晾干，在紫外光燈（254 nm）下進(jìn)行檢視。供試品色譜中在與對(duì)照藥材和對(duì)照品在相同位置顯示相同顏色的斑點(diǎn)，在與陰性對(duì)照色譜中相應(yīng)的位置上，未見(jiàn)任何斑點(diǎn)，表明該薄層鑒別專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好。見(jiàn)圖2。

圖2 甘草薄層色譜圖譜

2.1.3 大青葉 取靛玉紅對(duì)照品，加三氯甲烷制成0.1 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液，取大青葉對(duì)照藥材1 g加三氯甲烷50 mL超聲30 min，濾過(guò)，揮干濾液，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。除去大青葉，模擬處方，采用完全相同的方法制備陰性溶液。吸取對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液及鑒別項(xiàng)“2.1.1”下的供試品溶液、陰性溶液各 5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 G 薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出晾干，在日光下檢識(shí)[9]。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)（圖中箭頭所示），陰性色譜中相應(yīng)的位置上，未見(jiàn)任何斑點(diǎn)，表明該薄層鑒別專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好。見(jiàn)圖3。

圖3 大青葉薄層色譜圖譜

2.1.4 蘆根 取本品各10 g，加三氯甲烷回流提取2次，每次50 mL，濾過(guò)，合并濾液，回收溶劑，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取蘆根對(duì)照藥材1 g，加三氯甲烷25 mL，超聲30 min[10]，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解。除去蘆根，模擬處方，采用完全相同的方法制備陰性溶液，分別吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（4.5∶1.5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出晾干，噴以10%硫酸-乙醇試液，105℃加熱后，置紫外燈（365 nm）下[11]檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)（圖中箭頭所示），在與陰性對(duì)照色譜中相應(yīng)的位置上，未見(jiàn)任何斑點(diǎn)，表明該鑒別專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好。見(jiàn)圖4。

圖4 蘆根薄層色譜圖譜

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 測(cè)定制劑中靛玉紅（A）、甘草苷（B）的含量 色譜條件：流動(dòng)相A比B=甲醇-乙腈-0.4%磷酸溶液（33.5∶33.5∶33）比乙腈-冰醋酸 0.05%（60∶40）[12]；檢測(cè)波長(zhǎng)A比B=289 nm比238 nm；流速1.0 mL/min；柱溫35℃，進(jìn)樣量 10 μL。

2.2.2 樣品溶液配制 A對(duì)照品溶液：精密稱取A對(duì)照品，加三氯甲烷-甲醇（7∶3，V/V）[13]制成約 12 μg/mL 的溶液，搖勻，再精密吸取10 mL，加甲醇制成約12 μg/mL的溶液，即得。B對(duì)照品溶液：精密稱取B對(duì)照品，加甲醇制成約1 mg/mL的溶液。供試品溶液A：取3批本品，取1.5 g，置50 mL量瓶中，加甲醇超聲30 min，放冷，加甲醇至刻度，即得。供試品溶液B：取3批本品，取1.5 g，置100 mL錐形瓶中，加8%鹽酸溶液30 mL，再加三氯甲烷30 mL，回流提取1 h[14]，放冷，置分液漏斗中，取三氯甲烷層液，酸液用三氯甲烷提取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，揮干溶劑，殘?jiān)蛹状贾?0 mL量瓶，即得。

2.3 A方法學(xué)建立

2.3.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取供試品溶液，大青葉陰性對(duì)照溶液，A對(duì)照品溶液，注入HPLC儀測(cè)定，結(jié)果表明，大青葉陰性對(duì)照無(wú)干擾，專屬性良好。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取“2.2”項(xiàng)下A對(duì)照品溶液 2、4、8、10、12、16 μL，分別進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品含量為橫坐標(biāo)，以峰面積值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程 y=1471.2799x-52.6798（r＝ 0.9992），結(jié)果表明靛玉紅在0.057～0.46 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，符合外標(biāo)法要求。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積RSD為1.19%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液，分別于制備后 0、2、4、6、12、24 h，按同項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品（批號(hào)：20171213），6份，各1.5 g，精密稱定，置 50 mL錐形瓶中，按“2.2”項(xiàng)下供試品制備方法制備，取續(xù)濾液，即得。表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.6 回收率試驗(yàn) 取本品（批號(hào)：20171213），6份，各20 g，加入一定量的對(duì)照品，按“2.2”項(xiàng)下供試品制備方法制備，取續(xù)濾液，即得。見(jiàn)表1。

表1 靛玉紅回收率試驗(yàn)

2.3.7 疏清顆粒三批小試含量測(cè)定 取三批樣品各1.5 g，按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 疏清顆粒三批小試含量測(cè)定（μg/g）

2.4 B方法學(xué)建立

2.4.1 B專屬性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取供試品溶液，甘草陰性對(duì)照溶液、B對(duì)照品溶液，注入HPLC儀測(cè)定。結(jié)果表明甘草陰性無(wú)干擾，專屬性良好。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取“2.2”項(xiàng)下B對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于容量瓶中，加甲醇制成 0.02、0.04、0.08、0.1、0.12、0.14 mg/mL的溶液測(cè)定，以含量為橫坐標(biāo)，以峰面積值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程y=356 584x-2427.7（r＝ 0.9995），結(jié)果表明甘草苷在0.2～1.4 mg/mL范圍內(nèi)線性良好，符合外標(biāo)法要求。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液，按同一項(xiàng)下色譜譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積RSD為1.05%，表明精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液，分別于制備后 0、2、4、6、12、24 h 測(cè)定，峰面積 RSD 為0.96%（n=6）<2%，表明供試品在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品（批號(hào)：20171213）6份，各1.5 g，置50 mL錐形瓶中，按“2.2”項(xiàng)下供試品制備方法制備，取續(xù)濾液，即得，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.6 回收率試驗(yàn) 取本品（批號(hào)：20171213）6份，各20 g，加入一定量的對(duì)照品，按“2.2”項(xiàng)下供試品制備方法制備，取續(xù)濾液，即得。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 甘草苷回收率試驗(yàn)

2.4.7 疏清顆粒三批小試含量測(cè)定 稱取三批樣品各1.5 g，按“2.2”項(xiàng)下供試品制備方法制備。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 疏清顆粒三批小試含量測(cè)定結(jié)果（μg/g）

3 討論

TLC廣泛用于中藥材、提取物、制劑等質(zhì)量的定性鑒別，隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷精密化，目前質(zhì)量控制多偏向于液相[15]、氣相[16]等技術(shù)的使用，但TLC因價(jià)格低廉，實(shí)驗(yàn)迅速仍被廣泛地應(yīng)用于藥物研發(fā)中。

桑葉鑒別中，分別比較了三氯甲烷、甲醇等不同溶劑的提取效果，最終以三氯甲烷-甲醇（2∶3）超聲30 min 提取最完全，以甲苯-三氯甲烷-丙酮（4.8∶5.5∶1.1）為展開(kāi)劑，Rf值適中，各斑點(diǎn)清晰無(wú)拖尾。

蘆根具有清熱瀉火、生津止渴之功效[17]，回流提取優(yōu)于超聲提取，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（5.2∶1.5）為展開(kāi)劑，分離效果較好，Rf值適中，且陰性無(wú)干擾。

原標(biāo)準(zhǔn)中靛玉紅為質(zhì)控指標(biāo)，但對(duì)大青葉未做薄層鑒別，本文補(bǔ)充大青葉的TLC鑒別。因靛玉紅屬雙吲哚類生物堿[18]，在乙醚、三氯甲烷中溶解度高，故采用三氯甲烷富集。因靛玉紅本身是紫紅色，TLC鑒別時(shí)在日光下顏色明顯，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶1）為展開(kāi)劑，陰性無(wú)干擾。原標(biāo)準(zhǔn)中有石膏的鑒別、檢測(cè)項(xiàng)，本文通過(guò)驗(yàn)證，甘草中含有草酸鈣方晶[19-20]，陰性有干擾因此舍棄。分別考察甲醇-乙腈-水系統(tǒng)的檢測(cè)效果，發(fā)現(xiàn)在相同色譜條件下，各自分離度較佳，但都有拖尾現(xiàn)象，加入磷酸、冰醋酸，拖尾改善。

本研究通過(guò)TLC對(duì)疏清顆粒全方中藥材進(jìn)行鑒別，新增桑葉、蘆根、大青葉等鑒別項(xiàng)，甘草苷為質(zhì)控項(xiàng)。結(jié)果表明本法簡(jiǎn)單易行，斑點(diǎn)清晰，分離度好、重復(fù)性好，專屬性強(qiáng)且斑點(diǎn)清晰，陰性無(wú)干擾；所建立的疏清顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)高于原標(biāo)準(zhǔn)，提高了疏清顆粒的質(zhì)量，為以后質(zhì)量控制提供依據(jù)。