鄭向煒 吳佩穎 王 軍 王丹丹 阮克鋒 梁 爽 馮 怡

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)教育部工程研究中心，上海 201203；2.上海上藥杏靈科技藥業(yè)股份有限公司，上海 201703

銀杏酮酯（GBE）制劑現(xiàn)在已被廣泛用于心腦血管臨床，GBE含有6%的銀杏總內(nèi)酯，包括二萜類和倍半萜類，該類物質(zhì)為銀杏特有成分[1-2]。藥代動力學(xué)研究顯示該類成分不但能入血，而且能入腦[3-4]，故對其心腦血管活性有著不可替代的作用。藥效學(xué)研究顯示它對免疫系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、缺血損傷有保護作用，并有抗休克、抗過敏及抗炎作用[5-14]。藥理學(xué)研究顯示該類萜內(nèi)酯對血小板活化因子有顯著的特異性拮抗活性，其中銀杏內(nèi)酯B最顯著[15-20]。所以開發(fā)高純度銀杏內(nèi)酯制劑具有重大現(xiàn)實意義。本研究利用硅膠柱色譜-重結(jié)晶法使總內(nèi)酯純度提高到≥80%。符合注射劑原料含量的要求。

1 儀器與試藥

GBE由上海上藥杏靈科技藥業(yè)股份有限公司提供，其中銀杏總內(nèi)酯（銀杏內(nèi)酯 A、B、C、白果內(nèi)酯）HPLC純度6.35%；銀杏內(nèi)酯A（中國食品藥品檢定研究院，批號：110862-201310）；銀杏內(nèi)酯 B（中國食品藥品檢定研究院，批號：110863-201410）；銀杏內(nèi)酯C（中國食品藥品檢定研究院，批號：110864-201307）；白果內(nèi)酯（中國食品藥品檢定研究院，批號：110865-201306）。硅膠薄層板（青島海洋化工廠分廠，批號：20160102）；硅膠（青島海洋化工廠分廠）；玻璃色譜柱（規(guī)格：1 cm×20 cm，5 cm×65 cm）；高效液相色譜儀Agilent 1200 系列（Agilent Technologies，美國）；自動進樣器（Agilent Technologies，美國）；四元泵（Agilent Technologies，美國）；ELSD 檢測器（BUCHI，美國）；色譜純甲醇[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；其他化學(xué)試劑除特殊說明外均為化學(xué)純。

2 方法與結(jié)果

2.1 銀杏總內(nèi)酯含量測定方法

依照高效液相色譜法（中國藥典2010年版一部附錄Ⅵ D）測定。

2.1.1 色譜條件 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水（21∶79）為流動相；用蒸發(fā)光散射檢測器檢測。理論板數(shù)按白果內(nèi)酯峰計算應(yīng)不低于2500。

2.1.2 對照品溶液的制備 分別取銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各含上述對照品1 mg的混合溶液，作為對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取供試品150 mg，精密稱定，置索氏提取器中，加丙酮180 mL，加熱回流3次，提取液減壓濃縮至干，殘渣用醋酸甲酯30 mL溶解，移至分液漏斗中，剩余殘渣再用水15 mL溶解，并入同一分液漏斗中，振搖，分取乙酸甲酯液，水溶液再用乙酸甲酯30 mL振搖提取。合并醋酸甲酯提取液，減壓濃縮至干，殘渣用流動相溶解，移至5 mL容量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 測定法 分別精密吸取對照品溶液5、20 μL，供試品溶液注入液相色譜儀，測定，用外標(biāo)兩點法對數(shù)方程分別計算白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B和銀杏內(nèi)酯C的含量，即得。

2.2 薄層色譜系統(tǒng)考察

在各色譜系統(tǒng)中，二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)在高效硅膠薄層板上對GBE中4個銀杏內(nèi)酯成分的分離效果較好，故選擇該層析系統(tǒng)作為柱色譜的分離系統(tǒng)。見表1。

表1 不同色譜系統(tǒng)結(jié)果

2.3 柱色譜填料種類考察

取 5 g GBE 粉末，二氯甲烷-甲醇（1∶1，V/V）溶解，取200～300目硅膠15 g拌樣。另取200～300目硅膠，二氯甲烷浸泡過夜后，濕法裝柱，柱體積12.5 mL，樣品/填料質(zhì)量比為1∶40，干法上樣，二氯甲烷-甲醇（40∶1、35∶1，V/V）洗脫，收集、合并含銀杏內(nèi)酯 A、B、C及白果內(nèi)酯的流份。

選取200～300目中性氧化鋁，二氯甲烷浸泡過夜后，濕法裝柱，柱體積12.5 mL，按樣品/填料質(zhì)量比1∶30，二氯甲烷-甲醇（1∶1，V/V）溶解，拌樣，干法上樣，二氯甲烷-甲醇（40∶1、35∶1，V/V）洗脫，收集、合并含銀杏內(nèi)酯A、B、C、白果內(nèi)酯的流份。

在相同的柱體積下，中性氧化鋁柱的上樣量和回收率均顯著低于硅膠柱；而硅膠柱雖然上樣比例比中性氧化鋁柱高，但對銀杏內(nèi)酯的含量提高倍數(shù)仍高于中性氧化鋁柱，故選擇200～300目硅膠作為柱層析的色譜填料。見表2。

表2 填料種類篩選結(jié)果

2.4 硅膠柱色譜填料粒度考察

選擇 100～200、200～300 目兩種硅膠進行考察，過程如“2.3”項所示。200～300目硅膠柱色譜所得產(chǎn)物的含量較100～200目的高21.1%，但回收率卻相近，故選擇200～300目硅膠為柱色譜填料。見表3。

表3 填料粒度考察結(jié)果

2.5 硅膠柱色譜洗脫劑比例考察

考察二氯甲烷-甲醇（40∶1、35∶1）兩種不同比例洗脫，如“2.3”項操作。結(jié)果顯示比例為40∶1時，銀杏內(nèi)酯A、B以及白果內(nèi)酯被洗脫下來，35∶1時銀杏內(nèi)酯C被洗脫下來，根據(jù)薄層色譜合并流份。所合并的流份銀杏總內(nèi)酯的含量較高，回收率適中。故選擇洗脫劑比例為二氯甲烷-甲醇（40∶1、35∶1，V/V）。 見圖 1。

2.6 硅膠柱色譜上樣比例考察

選擇 1∶30、1∶50 兩種比例考察，過程如“2.3”項所示。結(jié)果顯示，以1∶50的上樣比例進行柱色譜，所得銀杏總內(nèi)酯的含量比按1∶30的高10.7%，但回收率卻相近，故選擇上樣比例為1∶50。見表4。

圖1 硅膠柱色譜洗脫劑篩選試驗HPLC-ELSD圖

表4 硅膠柱色譜上樣比例考察結(jié)果

2.7 驗證實驗

經(jīng)過單因素考察確定硅膠柱色譜各關(guān)鍵參數(shù)后，進行了100 g GBE粉末的放大驗證試驗，所得銀杏總內(nèi)酯部分含量為71.3%，回收率為62.3%，見圖2。

上述實驗結(jié)果說明該柱色譜工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。故硅膠柱色譜的工藝確定為：GBE粉末用二氯甲烷-甲醇（1∶1，V/V）溶解，取 1∶3 比例的 200～300 目硅膠拌樣，干法上樣。取200～300目硅膠，二氯甲烷浸泡過夜，濕法裝柱，樣品/填料質(zhì)量比為1∶50，二氯甲烷-甲醇（40∶1、35∶1，V/V）洗脫，TLC 監(jiān)控收集、合并含銀杏內(nèi)酯A、B、C及白果內(nèi)酯的流份。

圖2 硅膠柱色譜制備高純度銀杏內(nèi)酯驗證實驗HPLC-ELSD圖

2.8 精制工藝考察

經(jīng)多次篩選，最終選擇丙酮-水（1∶1，V/V）作為重結(jié)晶溶劑。將柱色譜所得產(chǎn)物加10倍量丙酮-水（1∶1，V/V）超聲溶解，4℃以下靜置過夜，即可獲得結(jié)晶，上述100 g GBE粉末原料經(jīng)單次硅膠柱色譜及單次重結(jié)晶后，所得產(chǎn)物的銀杏總內(nèi)酯含量高達81.4%，并且此時總回收率為55.4%。見圖3。

3 討論

目前，有報道利用聚酰胺、堿式氧化鋁柱色譜制備銀杏內(nèi)酯[21]，但均未使其純度提高到≥80%，本研究成功達到該目標(biāo)。

圖3 銀杏內(nèi)酯重結(jié)晶HPLC-ELSD圖

本研究在柱色譜過程中對流速的控制為常規(guī)的4 BV/h，對徑高比也采取了常規(guī)參數(shù)（1∶10），從研究結(jié)果看，達到了預(yù)期目的。