李永莉 趙 婧 劉黎明 張全波 劉 利 吳碧華

1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院老年科，四川南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，四川南充 637000

隨著人口老齡化的加劇，腦缺血導(dǎo)致的血管性認(rèn)知功能障礙（VCI）的發(fā)病率和死亡率逐漸提高，VCI患者生活能力和社會(huì)功能嚴(yán)重降低，已經(jīng)給家庭和社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān)[1]。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布廣泛，是一種作用于神經(jīng)的非選擇性營(yíng)養(yǎng)因子，能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，并調(diào)控其功能[2-3]。IGF-1水平與認(rèn)知障礙相關(guān)[4-5]。IGF-1與對(duì)應(yīng)受體結(jié)合后，通過PI3K/AKT信號(hào)通路將信號(hào)傳入核內(nèi)，導(dǎo)致相應(yīng)神經(jīng)元功能和結(jié)構(gòu)的改變[6]。本研究采用四血管阻斷法建立大鼠的全腦缺血模型，再分別給予IGF-1、IGF-1+PPP（IGF-1受體阻斷劑）進(jìn)行干預(yù)，探討IGF-1改善全腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar雄性大鼠110只[川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK（川）2013-18]，體重約300 g，8~10周齡。大鼠飼養(yǎng)間自然光照，溫度20℃，相對(duì)濕度45%~75%，飲食不限。采用簡(jiǎn)單隨機(jī)分組，將110只Wistar雄性大鼠分為正常組、假手術(shù)組、全腦缺血模型組、模型給藥組1及模型給藥組2，正常組和假手術(shù)組各10只，全腦缺血模型組、模型給藥組1及模型給藥組2各30只。本研究經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 側(cè)腦室置管術(shù)

腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛麻醉后顱骨中線備皮。將大鼠固定在腦立體定位儀上，根據(jù)Paxions等[7]的腦立體定位圖譜在顱骨上定位，并安置固定螺釘。在腦立體定位儀上固定微量注射導(dǎo)管，垂直埋設(shè)導(dǎo)管（硬膜下4.5 mm左右處）并固定，最后縫合創(chuàng)面。

1.3 全腦缺血模型的建立及給藥干預(yù)

1.3.1 全腦缺血造模方法 側(cè)腦室置管術(shù)后第6天建立全腦缺血模型。以10%水合氯醛麻醉大鼠，在操作臺(tái)上以俯臥位固定大鼠。按改良的Pulsinelli四血管法來建立全腦缺血的動(dòng)物模型[8-9]。以自制燒灼器凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈，再使氣管兩側(cè)的頸總動(dòng)脈游離并放置線系活結(jié)，把線縫合進(jìn)切口。24 h后提起頸總動(dòng)脈的放置系結(jié)，夾閉合雙側(cè)頸總動(dòng)脈20 min。全腦缺血造模成功標(biāo)準(zhǔn)[10]：①大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉后1 min內(nèi)意識(shí)喪失；②眼球逐漸變白，瞳孔散大，對(duì)光反射消失；③翻正反射消失，自主呼吸加快。

1.3.2 假手術(shù)組 手術(shù)過程除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈外，其余同全腦缺血造模方法。

1.3.3 各組給藥方法 全腦缺血模型組、模型給藥組1、模型給藥組2大鼠分別側(cè)腦室注射生理鹽水10 μL、IGF-1（0.2 μg/μL）10 μL、IGF-1+PPP（阻斷劑 PPP 腹腔注射20 mg/kg，側(cè)腦室注射IGF-1晚于腹腔注射30 min），1次/d，給藥時(shí)間共7 d。假手術(shù)組大鼠側(cè)腦室注射生理鹽水10 μL。

1.4 Morris水迷宮試驗(yàn)

分組前，先進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。采用定位航行和空間探索連續(xù)測(cè)試大鼠5 d，記錄基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并篩選游泳能力好、正常狀態(tài)的大鼠。連續(xù)給藥7 d后，再次行水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試各組大鼠，并收集相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.5 HE染色和免疫組化試驗(yàn)

水迷宮試驗(yàn)后以10%水合氯醛麻醉大鼠，心臟輸注新鮮4%多聚甲醛。手術(shù)剔除頭骨，取出變硬的大腦，并將大腦浸泡在4%多聚甲醛中12 h使之固定。從大腦底部視交叉前等距切分厚度為2 mm的腦組織，常規(guī)固定；采用石蠟包埋，大腦組織的石蠟切片厚度約為 5 μm。

1.5.1 HE染色 對(duì)大腦組織的石蠟切片進(jìn)行常規(guī)的HE染色，用光學(xué)顯微鏡放大400倍觀察大鼠海馬CA1區(qū)各神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，并選擇5個(gè)視野，拍片保存。

1.5.2 免疫組化測(cè)定 采用免疫組化方法處置大腦組織的石蠟切片，用光學(xué)顯微鏡放大400倍觀察大鼠海馬CA1區(qū)，并選擇5個(gè)視野，拍片保存。每個(gè)標(biāo)本選5個(gè)切片，圖片采用Image Pro Plus 6.0處理，統(tǒng)計(jì)指標(biāo)為IOD值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，方差齊并符合正態(tài)分布，組間比較采用SNK檢驗(yàn)；方差齊不符合正態(tài)分布或，組間比較采用Krμskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮實(shí)驗(yàn)

各組大鼠造模前原平臺(tái)象限游泳時(shí)間、跨躍平臺(tái)次數(shù)、平均逃避潛伏期差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。給藥后，與正常組比較，全腦缺血模型組和模型給藥組1的原平臺(tái)象限游泳時(shí)間、跨躍平臺(tái)次數(shù)明顯減少，平均逃避潛伏期顯著增加（P＜0.05）；與全腦缺血模型組比較，模型給藥組1的原平臺(tái)象限游泳時(shí)間更長(zhǎng)、跨躍平臺(tái)次數(shù)更多（P＜0.05），平均逃避潛伏期更短（P＜0.05）；與模型給藥組1比較，模型給藥組2的原平臺(tái)象限游泳時(shí)間更短、跨躍平臺(tái)次數(shù)更少（P＜0.05），平均逃避潛伏期增加（P＜0.05）。 見表1。

2.2 HE染色

HE染色結(jié)果顯示，全腦缺血模型組及模型給藥組2大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞異常，層次紊亂、細(xì)胞減少、排列稀疏，細(xì)胞核不規(guī)則，部分固縮。與全腦缺血模型組比較，模型給藥組1海馬CA1區(qū)細(xì)胞數(shù)增加，排列整齊均勻，結(jié)構(gòu)較清晰。見圖1。

表1 造模前和給藥后各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

表1 造模前和給藥后各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

注：與正常組比較，*P<0.05；與全腦缺血模型組比較，#P<0.05；與模型給藥組1比較，&P<0.05

組別正常組假手術(shù)組全腦缺血模型組模型給藥組1模型給藥組2造模前只數(shù) 跨躍平臺(tái)次數(shù)（次）原平臺(tái)象限游泳時(shí)間（s）平均逃避潛伏期（s）給藥后只數(shù) 跨躍平臺(tái)次數(shù)（次）原平臺(tái)象限游泳時(shí)間（s）平均逃避潛伏期（s）10 10 30 30 30 2.9±1.2 3.6±1.4 3.1±1.0 3.3±1.1 3.4±1.0 26.5±2.7 27.8±2.2 26.9±2.3 26.5±2.2 26.6±1.7 46.8±3.5 44.0±3.8 45.3±3.2 44.8±3.0 44.1±3.0 10 7 11 10 11 3.7±1.6 3.9±0.7 1.3±0.6*2.3±1.0#1.1±0.7&29.0±2.2 28.4±4.6 11.8±2.2*19.1±2.1#11.6±2.6&31.2±3.3 32.4±2.5 52.1±5.0*41.7±3.6#51.1±2.2&

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)HE染色結(jié)果（400×）

2.3 免疫組化

免疫組化結(jié)果顯示，假手術(shù)組和正常組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與正常組和假手術(shù)組比較，全腦缺血模型組的p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與正常組、假手術(shù)組和全腦缺血模型組比較，模型給藥組1的p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)更高（P＜0.05）。與全腦缺血模型組比較，模型給藥組2的p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型給藥組1比較，模型給藥組 2的p-Akt、pmTOR蛋白表達(dá)顯著減少（P＜0.05）。見表2。

3 討論

3.1 IGF-1

IGF-1與腦缺血損傷呈現(xiàn)相關(guān)性[3]。郭義君等[11]指出，急性顱腦損傷患者血漿IGF-1水平明顯降低，且與認(rèn)知功能密切相關(guān)。褚忠海等[12]發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)下缺血性腦血管病患者血清IGF-1降低。吳至鳳等[13]研究提示IGF-1水平低下可能是腦癱兒童認(rèn)知水平損害的原因。

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)p-Akt、p-mTOR的IOD值（±s）

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)p-Akt、p-mTOR的IOD值（±s）

注：與正常組比較，*P<0.05；與假手術(shù)組比較，△P<0.05；與全腦缺血模型組比較，#P<0.05，與模型給藥組1比較，&P<0.05

組別 只數(shù) p-Akt p-mTOR正常組假手術(shù)組全腦缺血模型組模型給藥組1模型給藥組2 10 7 11 10 11 6458.70±243.60 5864.80±508.60 9058.60±214.86*△46549.50±756.50#8587.70±314.60&4101.20±115.50 4109.20±90.30 7022.10±63.50*△26828.60±1031.20#6981.00±295.80&

IGF-1可以通過血-腦屏障的IGF-1受體進(jìn)入大腦，從而發(fā)揮作用[14]。經(jīng)鼻、皮下和靜脈等方式給予IGF-1有效。Rizk等[15]發(fā)現(xiàn)靜脈給予IGF-1，可減少大鼠腦梗死面積，同時(shí)能改善神經(jīng)元的凋亡。石廣濱[16]研究顯示IGF-1能夠改善癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，且小劑量改善效果比大劑量好?；毖牌糩17]在腦室置管7 d后，對(duì)C57BL/6小鼠行腦反復(fù)缺血再灌注手術(shù)，手前及術(shù)后24 h經(jīng)側(cè)腦室給予2 μL IGF-1，可以改善VaD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。外源性IGF-1對(duì)改善血管性認(rèn)知障礙大鼠學(xué)習(xí)記憶的作用及其相關(guān)機(jī)制鮮有報(bào)道。給藥方式、劑量、持續(xù)時(shí)間等仍需要進(jìn)一步的研究。本研究考慮到外周給藥雖然能夠透過血腦屏障，但能夠到達(dá)腦組織中的具體濃度不明確，且不同大鼠之間可能存在個(gè)體差異，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在影響，故仍然選擇側(cè)腦室置管進(jìn)行側(cè)腦室給藥的方式。注射劑量選擇小劑量，即 0.2 μg/μL，注射時(shí)間為連續(xù)7 d，初步探討作外源性給予IGF-1的作用。HE染色和水迷宮結(jié)果提示，外源性的IGF-1能夠改善海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡，明顯提高全腦缺血再灌注大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，這一作用能夠被其受體阻斷劑抑制。

3.2 PI3K/AKT信號(hào)通路與血管性認(rèn)知障礙

磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3 kinase/Akt，PI3K/Akt）是一條參與細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[16]。PI3K是磷脂激酶激酶家族中的重要成員，具有蛋白激酶活性以及脂類激酶活性。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K/Akt信號(hào)通路的主要信號(hào)分子。該通路被PI3K激活后，活化底物，從而對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、凋亡產(chǎn)生影響。全腦缺血或者是局灶性腦缺血以后，p-Akt（Ser473）增加，而總Akt的表達(dá)沒有變化，提示缺血損傷的神經(jīng)元存活與Akt的磷酸化相關(guān)，與總Akt的水平無相關(guān)性[18]。PI3-Akt通路可分成多條信號(hào)支流發(fā)揮其作用，其中雷帕霉素靶蛋白（mTor）是該通路下游非常重要的效應(yīng)器。近年來，大量研究表明IGF-1通過mTor發(fā)揮作用，阻斷mTor信號(hào)能夠抑制體外的少突膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)[19]。Yi等[20]的研究顯示，缺血性大鼠磷酸化的p-mTor表達(dá)明顯增加，而mTor水平不變，說明磷酸化的mTor在通過中發(fā)揮作用。所以本研究選擇p-Akt和pmTor蛋白作為檢測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路的指標(biāo)。全腦缺血模型組大鼠p-Akt和p-mTor蛋白表達(dá)均顯著性提高，與文獻(xiàn)[18,20]相符。給予IGF-1后，成模大鼠學(xué)習(xí)記憶能力改善，p-Akt和p-mTor蛋白表達(dá)增加；加用IGF-1受體阻斷劑后p-Akt和p-mTor蛋白表達(dá)與未給予IGF-1成模大鼠差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。由此，推測(cè)外源性IGF-1可改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，該作用可能與PI3K/Akt通路的激活，p-AKt和p-mTOR蛋白表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)。