趙文明，王 森，陳艷萍，張美景，袁建華

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，江蘇 南京 210014)

鮮食糯玉米因其營(yíng)養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特，適口性好而成為農(nóng)產(chǎn)品新寵，深受消費(fèi)者青睞，市場(chǎng)需求激增，種植面積逐年擴(kuò)大。近年來(lái)，江蘇省糯玉米年種植面積達(dá)10萬(wàn)hm2以上，已發(fā)展成為高效農(nóng)業(yè)重要組成部分，促進(jìn)了農(nóng)民增收、農(nóng)業(yè)增效和農(nóng)村發(fā)展。江蘇是國(guó)內(nèi)較早開(kāi)展糯玉米育種研究的單位，擁有豐富的糯玉米種質(zhì)資源。研究江蘇糯玉米種質(zhì)和其他地區(qū)糯玉米種質(zhì)的遺傳多樣性與親緣關(guān)系，對(duì)于促進(jìn)其他地區(qū)種質(zhì)在江蘇糯玉米育種中的利用、拓寬江蘇糯玉米種質(zhì)資源具有重要意義。糯玉米種質(zhì)多來(lái)源于農(nóng)家品種和雜交種，多數(shù)自交系親緣關(guān)系不清楚。SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、共顯性、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于糯玉米自交系遺傳多樣性的研究[1-12]。北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心設(shè)計(jì)了一套適于中國(guó)玉米種質(zhì)資源、尤其是自交系研究的核心標(biāo)記，包括40個(gè)核心SSR標(biāo)記和20個(gè)候選核心SSR標(biāo)記[13]。這些標(biāo)記具有良好的穩(wěn)定性與極高的多態(tài)性，一直用于中國(guó)玉米品種一致性鑒定以及中國(guó)玉米自交系與雜交種指紋圖譜的構(gòu)建[14-16]。目前，利用這些核心SSR標(biāo)記對(duì)糯玉米自交系的遺傳多樣性的研究相對(duì)較少。本研究利用60個(gè)核心SSR標(biāo)記分析68份糯玉米自交系的遺傳差異及親緣關(guān)系，旨在為江蘇糯玉米種質(zhì)的改良和利用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為68份糯玉米自交系(見(jiàn)表1)。Tris、NaCl、EDTA、β-巰基乙醇、丙烯酰胺、N,N′-亞甲雙丙烯酰胺、尿素、硼酸、無(wú)水乙醇、硝酸銀、10 PCR×Buffer(含MgCl2)、TaqDNA聚合酶(5 U/μL)、dNTP購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。NanoDrop 2000C超微量分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，PCR儀購(gòu)自中國(guó)Long Gene公司，DYCZ-20C垂直電泳槽購(gòu)自北京六一生物科技有限公司。

表1 68份糯玉米自交系名稱及地理來(lái)源

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取與檢測(cè) 供試材料于幼苗長(zhǎng)至4片葉時(shí)，取新鮮葉片冷凍干燥后在自動(dòng)磨樣機(jī)上研磨，采用改良的CTAB法提取基因組總DNA，利用NanoDrop 2000C超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和質(zhì)量。采用滅菌超純水將DNA樣品濃度稀釋至50 ng/μL，放在-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)文獻(xiàn)Development and characterization of a core set of SSR markers for fingerprinting analysis of Chinese maize varieties[13]公布的60個(gè)核心SSR標(biāo)記的名稱、序列等信息(見(jiàn)表2)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物檢測(cè) PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Long Gene公司的MG96G型PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)總體系10 μL。其中，10 PCR×Buffer(含MgCl2) 2 μL、2 mmol/L dNTP 0.2 μL、TaqDNA聚合酶(5 U/μL) 0.1 μL、DNA 模板(25 ng/μL) 1 μL、引物 1 μL、ddH2O 5.7 μL。PCR反應(yīng)過(guò)程為94 ℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃預(yù)變性40 s，60 ℃復(fù)性35 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；最后于72 ℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增完成后，PCR產(chǎn)物利用6%聚丙烯酰胺變性凝膠電泳檢測(cè)，以東盛生物M1041作為DNA分子量標(biāo)記。電泳完畢后，硝酸銀染色，照相。

表2 60個(gè)核心SSR標(biāo)記的基本信息

續(xù)表2：

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Power-Marker V3.25軟件計(jì)算60個(gè)SSR標(biāo)記在所有自交系上的等位變異數(shù)、基因多樣性(Gene diversity)和多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)。采用Nei′s 1973算法計(jì)算自交系間遺傳距離(GD)，利用GD值按UPGMA進(jìn)行遺傳相似性聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記的多態(tài)性分析

60個(gè)核心SSR標(biāo)記在68份糯玉米自交系中擴(kuò)增到414個(gè)等位變異，每個(gè)標(biāo)記檢測(cè)出的等位變異數(shù)為3～13個(gè)，平均為6.9個(gè)。在這些標(biāo)記中，等位變異最多的是bnlg1191k7，檢測(cè)出13個(gè)；最少的則是umc1432y6，檢測(cè)出3個(gè)。60個(gè)標(biāo)記的多態(tài)性信息量(PIC)介于0.4630～0.8515之間，平均為0.7144。在這些標(biāo)記中，bnlg2235y5的PIC最低，為0.4630；bnlg1191k7的PIC最高，為0.8515；11個(gè)標(biāo)記的 PIC>0.8。68份糯玉米自交系的基因多樣性變幅為0.4982～0.9124，平均為0.7603。60個(gè)核心標(biāo)記所揭示的基因多樣性差異較大，其中，bnlg2235y5、umc1705w1、umc1432y6揭示的基因多樣性低于0.6，49個(gè)標(biāo)記則超過(guò)0.7，有15個(gè)超過(guò)0.9 (見(jiàn)表3)。

2.2 供試材料的聚類(lèi)分析

群體內(nèi)個(gè)體間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近通常由遺傳距離的大小來(lái)反映。群體內(nèi)個(gè)體間遺傳距離小，說(shuō)明親緣關(guān)系近，遺傳多樣性低；遺傳距離大，說(shuō)明親緣關(guān)系遠(yuǎn)，遺傳多樣性高。采用Nei′s 1973算法計(jì)算68個(gè)糯玉米自交系間遺傳距離(GD)。68個(gè)糯玉米自交系的遺傳距離，變幅為0.1800～0.9600，平均為0.7402。68份自交系的遺傳距離分析表明，89.79%的自交系間遺傳距離分布在0.6100～0.9600之間，說(shuō)明供試材料間的遺傳距離較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。其中，25.23%的遺傳距離分布在0.8100～0.9600之間，說(shuō)明這些成對(duì)自交系之間的親緣關(guān)系較弱。10.21%的自交系間遺傳距離分布在0.1800～0.6000之間，表明這些自交系之間有不同程度的親緣關(guān)系。0.75%的自交系間遺傳距離分布在0.1800～0.4000之間，說(shuō)明這些成對(duì)自交系間有很大的親緣相關(guān)性。68份自交系之間，靖黑糯001與JDN003的遺傳距離最大，為0.9600；DN830與LBN2586、QW85與LBN2586、QW85與衡白522之間的遺傳距離次之，為0.9400，說(shuō)明這4對(duì)自交系間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。JSW0388與JSW6238的遺傳距離最小，為0.1800；JSW10684與JSW10722、T361與通系5的遺傳距離次之，為0.2200，說(shuō)明這3對(duì)自交系之間親緣關(guān)系最近。此結(jié)果與自交系的來(lái)源基本一致，也表明68份糯玉米自交系有廣泛的遺傳基礎(chǔ)，遺傳多樣性豐富(見(jiàn)圖1)。

表3 60個(gè)核心SSR標(biāo)記的遺傳多樣性統(tǒng)計(jì)

續(xù)表3：

2.3 供試材料的聚類(lèi)分析

根據(jù)68份糯玉米自交系在60個(gè)核心SSR標(biāo)記的基因型數(shù)據(jù)，運(yùn)用Power Marker V3．25 軟件，采用Nei′s 1973 算法計(jì)算自交系之間的遺傳距離，構(gòu)建UPGMA聚類(lèi)圖，進(jìn)行聚類(lèi)分析。聚類(lèi)分析結(jié)果表明，68份自交系被劃分為5大類(lèi)群(見(jiàn)圖2、表4)。第一類(lèi)群以JS0381為代表，包括11個(gè)自交系，稱為JS0381類(lèi)群；第二類(lèi)群以衡白522為代表，包括15個(gè)自交系，稱為衡白522類(lèi)群；第三類(lèi)群以西南地區(qū)優(yōu)良糯玉米自交系S181為代表，包括9個(gè)自交系，稱為S181類(lèi)群；第四類(lèi)群以通系5為代表，包括19個(gè)自交系，稱為通系5類(lèi)群；第五類(lèi)群包括14個(gè)自交系，這些自交系地理來(lái)源廣泛，未能明確地劃分到其他4個(gè)類(lèi)群，稱為中間類(lèi)群。將類(lèi)群劃分結(jié)果與自交系系譜來(lái)源進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)聚類(lèi)分析結(jié)果與自交系來(lái)源基本一致(見(jiàn)表5)。此結(jié)果表明，60個(gè)核心SSR標(biāo)記可用于糯玉米自交系類(lèi)群劃分。通過(guò)聚類(lèi)分析和遺傳距離分析，可以將一些來(lái)源不清晰的糯玉米自交系劃分至不同的類(lèi)群中，明確了與其它自交系間的親緣關(guān)系，可提高其利用效率。

圖1 68份糯玉米自交系之間的遺傳距離(GD)分布

圖2 基于SSR標(biāo)記的68份糯玉米自交系UPGMA聚類(lèi)圖

2.4 江蘇糯玉米雜種優(yōu)勢(shì)模式分析

合理準(zhǔn)確地劃分玉米自交系雜種優(yōu)勢(shì)群，建立相應(yīng)的雜優(yōu)模式，才能有效地改良自交系和選配雜交組合，提高育種效率和水平。糯玉米自交系雜種優(yōu)勢(shì)群的劃分和雜種優(yōu)勢(shì)利用模式的建立，有利于糯玉米育種水平的提高和發(fā)展[17]。本研究聚類(lèi)分析結(jié)果表明，江蘇糯玉米自交系主要是通系5和衡白522的衍生系，劃分為通系5 類(lèi)群和衡白522 類(lèi)群；以此為基礎(chǔ)組配雜交組合，育成了蘇玉糯1號(hào)、蘇玉糯2號(hào)、蘇玉糯639、蘇玉糯901、江南花糯、蘇科花糯2008、蘇科糯3號(hào)、蘇科糯4號(hào)、蘇科糯5號(hào)、蘇科糯9號(hào)、蘇科糯1505，形成了通系5 類(lèi)群×衡白522 類(lèi)群的雜種優(yōu)勢(shì)利用模式。江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所以糯玉米雜交種中糯1號(hào)和FP0702為基礎(chǔ)材料，育成了糯玉米自交系JS0381、JS04388、JS0388、JSW10721、JSW1166，形成了JS0381類(lèi)群；以糯玉米雜交種黔糯968和國(guó)家玉米產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系交換材料WX004為基礎(chǔ)材料，育成了糯玉米自交系JSW15180和JSW15227，劃分到S181類(lèi)群。JS0381、JS04388、JS0388、JSW10721與JS0382、JS09116、JSW10722和JSW10684組配雜交組合，育成了蘇科糯2號(hào)、蘇科糯6號(hào)、蘇科糯8號(hào)、明玉1203，形成了JS0381類(lèi)群×通系5類(lèi)群的雜種優(yōu)勢(shì)利用模式；JSW1166與WX004、JSW15227組配雜交組合，育成了蘇科糯10號(hào)、蘇科糯1703，形成了JS0381類(lèi)群×S181類(lèi)群的雜種優(yōu)勢(shì)利用模式；JS0581、JSW12471與JSW15180組配雜交組合，育成了蘇科糯1704、蘇科糯1701，形成了衡白522類(lèi)群×S181類(lèi)群的雜種優(yōu)勢(shì)利用模式(見(jiàn)表5)。本研究表明，通系5 類(lèi)群×衡白522 類(lèi)群仍是江蘇糯玉米育種主要的雜種優(yōu)勢(shì)模式；引進(jìn)的新種質(zhì)已逐步在江蘇糯玉米育種中得到應(yīng)用，拓寬了江蘇糯玉米種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)，形成了JS0381類(lèi)群×通系5類(lèi)群、JS0381類(lèi)群×S181類(lèi)群、衡白522類(lèi)群×S181類(lèi)群的雜種優(yōu)勢(shì)模式。盡管這些新種質(zhì)及其雜種優(yōu)勢(shì)模式目前尚未在江蘇糯玉米育種中占主導(dǎo)地位，但其具有較為豐富的遺傳多樣性及存在許多優(yōu)異種質(zhì)資源，這將是江蘇未來(lái)糯玉米育種取得突破的關(guān)鍵。

表4 68份糯玉米自交系類(lèi)群劃分明細(xì)

3 結(jié)論與討論

3.1 糯玉米自交系的遺傳多樣性

本研究結(jié)果表明，基于60個(gè)核心SSR標(biāo)記所揭示的68份糯玉米自交系的平均等位變異為6.9個(gè)，基因多樣性為0.7603，多態(tài)性信息量為0.7144，高于前人基于普通SSR標(biāo)記對(duì)糯玉米自交系遺傳多樣性的分析結(jié)果[2-12]。這可能與本研究所用自交系的來(lái)源廣泛和SSR標(biāo)記的多態(tài)性較高有關(guān)。

3.2糯玉米自交系的類(lèi)群劃分

利用聚類(lèi)分析將不同來(lái)源的糯玉米種質(zhì)進(jìn)行分類(lèi)，明確其親緣關(guān)系，可為糯玉米種質(zhì)的改良和優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)組合的組配提供參考依據(jù)。在糯玉米自交系類(lèi)群劃分研究上，前人做了較多研究。受標(biāo)記數(shù)量多少、研究材料來(lái)源及數(shù)量、標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種等因素的影響，不同報(bào)道在類(lèi)群個(gè)數(shù)、類(lèi)群名稱的確定上存在一定的差異[3-12,18]。北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心以糯玉米雜交種中糯1號(hào)為基礎(chǔ)材料，育成了自交系京糯6，形成了京糯6類(lèi)群；以糯玉米雜交種紫糯3號(hào)為基礎(chǔ)材料，育成了自交系BN2，劃分到Reid類(lèi)群[18]。本研究中，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所以糯玉米雜交種中糯1號(hào)為基礎(chǔ)材料，育成了自交系JS0381、JS04388、JS0388，形成了JS0381類(lèi)群；京糯6與JS0381類(lèi)群自交系聚類(lèi)在一起，BN2與衡白522類(lèi)群自交系聚類(lèi)在一起。本研究利用60個(gè)核心SSR標(biāo)記，通過(guò)UPGMA 聚類(lèi)分析，將68份自交系劃分為5個(gè)類(lèi)群，劃分結(jié)果與自交系來(lái)源基本一致，與前人報(bào)道也表現(xiàn)出了一定的一致性，說(shuō)明核心SSR標(biāo)記可用于糯玉米自交系遺傳多樣性分析及類(lèi)群劃分，并能取得良好效果。

3.3 糯玉米雜種優(yōu)勢(shì)利用模式

玉米育種研究的關(guān)鍵在于合理準(zhǔn)確地劃分雜種優(yōu)勢(shì)群和建立雜種優(yōu)勢(shì)利用模式。沈錦根等[17]研究認(rèn)為通系5類(lèi)群和衡白522類(lèi)群為江蘇糯玉米主要雜種優(yōu)勢(shì)群，通系5類(lèi)群×衡白522類(lèi)群是主要雜優(yōu)模式。史亞興等[18]研究認(rèn)為京糯6群×Reid群是我國(guó)糯玉米品種選育的主要雜優(yōu)模式。張勝恒等[19]研究認(rèn)為S181類(lèi)群、衡白522類(lèi)群為重慶糯玉米育種主要雜優(yōu)類(lèi)群，S181類(lèi)群×衡白522類(lèi)群為主要雜優(yōu)模式。本研究表明，通系5類(lèi)群×衡白522類(lèi)群仍是江蘇糯玉米育種主要的雜種優(yōu)勢(shì)模式，已形成了JS0381類(lèi)群×通系5 類(lèi)群、JS0381類(lèi)群×S181類(lèi)群、衡白522類(lèi)群×S181類(lèi)群的雜種優(yōu)勢(shì)模式。一些來(lái)源不清晰的糯玉米自交系被劃分至不同類(lèi)群中，依據(jù)此結(jié)果進(jìn)行糯玉米雜交種組配，可以避免盲目測(cè)配，提高利用效率。糯玉米育種工作中，不僅要考慮雜種優(yōu)勢(shì)，還要考慮品質(zhì)性狀、抗病性、抗蟲(chóng)性、抗逆性等，培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、廣適的品種。

表5 江蘇省育成的部分糯玉米品種親本自交系系譜來(lái)源

60個(gè)核心SSR標(biāo)記適用于糯玉米自交系的遺傳多樣性分析及親緣關(guān)系研究，類(lèi)群劃分結(jié)果基本符合自交系的來(lái)源情況。68份糯玉米自交系的遺傳多樣性相對(duì)豐富，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，作為糯玉米種質(zhì)資源利用及品種選育具有一定的價(jià)值。