王雨竹 吳安石 岳 云

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院麻醉科，北京100020）

一、引言

疼痛是機體對外界傷害或內(nèi)在疾病的反應(yīng)機制，正常痛覺對個體感知危險和躲避危害至關(guān)重要?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)將疼痛列為除呼吸、脈搏、血壓、體溫之外的第五大生命體征。2002 年國際疼痛學(xué)會(International Association for the Study of Pain, IASP) 專家共識正式將慢性疼痛定義為一種疾病。依據(jù)病理機制，慢性疼痛可分為傷害性/炎癥性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain)。前者的痛覺感受正常，而后者常伴有自發(fā)性疼痛(spontaneous pain)、痛覺過敏(hyperalgesia) 及痛覺超敏(allodynia)。病人的痛覺感受異常強烈，疼痛評分顯著高于其他慢性疼痛人群，生活質(zhì)量顯著低于非神經(jīng)病理性慢性疼痛病人，伴發(fā)睡眠障礙和精神障礙的概率顯著增高[1]。神經(jīng)病理性疼痛是極具異質(zhì)性的一類疾病，其病程遷延，常規(guī)的神經(jīng)阻滯、外科手術(shù)、以及阿片類強鎮(zhèn)痛藥物的治療效果都不甚理想，一直是疼痛治療領(lǐng)域的難題。與此同時，神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病率也不斷增加，2017年一項流行病學(xué)調(diào)查顯示，神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病率在50歲以上人群中高達8.9%，在50歲以下人群中也占5.6%[2]，給家庭和社會醫(yī)療系統(tǒng)帶來沉重負擔(dān)，成為疼痛領(lǐng)域亟需解決的難題之一。近年來，隨著人們對干細胞領(lǐng)域研究的不斷深入，國內(nèi)外學(xué)者開始嘗試將干細胞移植用于神經(jīng)病理性疼痛的治療。本文歸納總結(jié)了神經(jīng)病理性疼痛治療相關(guān)的干細胞類別，闡述干細胞移植應(yīng)用于神經(jīng)病理性疼痛治療的新進展，圍繞干細胞在神經(jīng)病理性疼痛治療中的前景與問題展開討論，為后繼研究提供參考與啟示。

二、概述

神經(jīng)病理性疼痛是由軀體感覺系統(tǒng)的損害或疾病導(dǎo)致的疼痛[3]。外周的疼痛信號經(jīng)脊髓背角，向中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)傳遞。中腦藍斑、中縫大核和臨近網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)參與痛覺信號調(diào)控，并投射至大腦皮層[4]。這一通路上任何環(huán)節(jié)發(fā)生異常，均有可能導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生。神經(jīng)病理性疼痛多表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛或誘發(fā)性疼痛，前者包括無明顯誘因的陣發(fā)性刺痛或表面燒灼樣疼痛，后者包括機械誘發(fā)或熱誘發(fā)痛（即正常非致痛性觸碰或溫度即引起劇烈疼痛）和痛覺過敏（對正常致痛性刺激的敏感閾值降低），可伴有感覺異?；蚋杏X減退[3]。多數(shù)神經(jīng)病理性疼痛在誘發(fā)因素消除或原發(fā)病治愈后長期存在，給病人帶來極大的痛苦。

神經(jīng)病理性疼痛的病因包括：周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、多發(fā)性神經(jīng)病(polyneuropathies)和復(fù)雜的神經(jīng)性疾病(complex neuropathic disorders)[5]。其發(fā)病機制尚未完全明確，可能涉及神經(jīng)元、炎癥免疫細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞間相互作用、外周/中樞敏化、炎癥因子和抗炎因子的瀑布式級聯(lián)反應(yīng)[6]。由于疾病的異質(zhì)性，臨床上對于神經(jīng)病理性疼痛的治療效果多不理想。目前，藥物治療仍是神經(jīng)病理性疼痛最主要的治療方式，但IASP推薦的一線治療藥物（鈣離子通道調(diào)節(jié)劑、抗抑郁藥、抗癲癇藥、局部麻醉藥貼劑等）對神經(jīng)病理性疼痛的緩解有限，且隨著用藥時間的延長，藥物的藥效逐漸下降。其他治療方法包括神經(jīng)調(diào)控技術(shù)（神經(jīng)電刺激、鞘內(nèi)藥物輸注）、微創(chuàng)治療（神經(jīng)阻滯、射頻治療、神經(jīng)毀損）和手術(shù)治療，但療效也不盡理想[7]。

三、干細胞治療在神經(jīng)病理性疼痛疾病模型中的研究

干細胞是一類具有自我復(fù)制能力(self-renewing) 的多潛能細胞。在一定條件下可分化為多種細胞。哺乳動物干細胞依據(jù)細胞的發(fā)育潛能可分為全能干細胞(totipotent stem cell, TSC)、多能干細胞(pluripotent stem cell) 和專能干細胞(unipotent stem cell)。依據(jù)細胞發(fā)育階段，可分為胚胎干細胞(embryonic stem cells)和成體干細胞(adult stem cells)。干細胞移植途徑包括靜脈輸注、腹膜腔內(nèi)輸注、損傷處原位輸注、鞘內(nèi)輸注、側(cè)腦室輸注等。目前用于神經(jīng)病理性疼痛治療研究的干細胞主要分為三類，分別是神經(jīng)干細胞(neural stem cells)、間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSC)、和誘導(dǎo)的多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)。

1.神經(jīng)干細胞在神經(jīng)病理性疼痛治療中的作用

（1）胚胎干細胞誘導(dǎo)的神經(jīng)干細胞：人類卵子在受精后4～5天，胚胎到達囊胚期，由50～150個細胞組成，即為早期胚胎。胚胎干細胞源于早期胚胎胚泡的內(nèi)部細胞群，具有多能性。理論上，在特定的環(huán)境刺激下，胚胎干細胞可以發(fā)展成成人身體的200多種細胞類型。目前胚胎干細胞研究多利用了小鼠胚胎干細胞或人類胚胎干細胞。早期胚泡內(nèi)部細胞群中提取的胚胎干細胞需要非常特殊的環(huán)境以維持未分化的狀態(tài)，如血清培養(yǎng)基中需要存在白血病抑制因子(LIF)、成纖維細胞生長因子(bFGF或FGF-2等)，否則將會迅速分化[8]。在神經(jīng)病理性疼痛治療的相關(guān)研究中，胚胎干細胞多在體外被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)前體細胞或干細胞。

2005年，Cummings BJ等人首次將人類干細胞在體外誘導(dǎo)分化后移植給小鼠，并在一定程度上緩解小鼠脊髓損傷癥狀。后續(xù)研究證實，將人類胚胎干細胞誘導(dǎo)分化或進行重組后的神經(jīng)元前體移植給脊髓損傷小鼠，可以減輕脊髓損傷后的小鼠膀胱功能障礙和神經(jīng)病理性疼痛[9,10]。移植的神經(jīng)干細胞幾乎只會分化成為星形膠質(zhì)細胞，只有極少數(shù)分化為少突膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元[11]。這表明神經(jīng)干細胞移植后的神經(jīng)功能改善，主要得益于星形細胞提供的營養(yǎng)支持性作用[11]。移植的干細胞可以提供保護性的微環(huán)境，分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，如神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子3(neurotrophin 3) 等，促進神經(jīng)元的修復(fù)和再生。

（2）成體神經(jīng)干細胞：除外胚胎干細胞誘導(dǎo)分化途徑，神經(jīng)干細胞還可以從成年哺乳動物大腦側(cè)腦室的室管膜下區(qū)(subventricular zone, SVZ) 和海馬體齒狀回(dentate gyrus, DG) 的顆粒下層(subgranular zone, SGZ) 獲得[12]。這些多潛能前體細胞在培養(yǎng)過程中能夠不斷生長和自我更新，并保持著分化為成熟的具有功能的神經(jīng)細胞的能力。

神經(jīng)受損后發(fā)生病理性修復(fù)，當(dāng)神經(jīng)受損斷端形成神經(jīng)瘤，導(dǎo)致經(jīng)傳導(dǎo)改變和神經(jīng)自發(fā)性放電等現(xiàn)象，被認為是引起病理性神經(jīng)痛的重要原因之一。神經(jīng)病理性疼痛病變機制涉及神經(jīng)細胞損傷，神經(jīng)干細胞可能是干細胞治療神經(jīng)病理性疼痛中的優(yōu)先選擇。相關(guān)研究表明，損傷部位的神經(jīng)干細胞能促進神經(jīng)修復(fù)，從而減少痛覺過敏和異位疼痛等神經(jīng)病理性疼痛的癥狀[13]。通過分離嚙齒類動物室管膜下區(qū)神經(jīng)干細胞，并標記上綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP) 報告基因，研究者已經(jīng)能夠追蹤移植神經(jīng)干細胞的遷移路線并對干細胞移植的效率進行定位和定量檢測，從而監(jiān)測干細胞移植的安全性和有效性（Hofstetter CP等.2005）。新近研究發(fā)現(xiàn)，低氧可誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞過表達血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，誘導(dǎo)血管生成，促進損傷神經(jīng)單元的修復(fù)，提高神經(jīng)干細胞治療神經(jīng)病理性疼痛的安全性和治療效率[14]。

目前神經(jīng)干細胞移植多使用從嚙齒動物SVZ區(qū)中分離出來的前體細胞或神經(jīng)干細胞，并以嚙齒動物為模型進行移植治療。盡管有研究嘗試將神經(jīng)干細胞移植應(yīng)用于慢性疼痛病人，但其對病人神經(jīng)功能恢復(fù)及疼痛改善的影響仍有待商榷[15,16]。神經(jīng)干細胞由基礎(chǔ)實驗室向臨床轉(zhuǎn)變的過程還存在一些問題，包括神經(jīng)干細胞的供體來源問題，以及干細胞移植于神經(jīng)受損處后的存活率問題。此外，還有研究觀察到神經(jīng)干細胞移植后發(fā)生異位疼痛現(xiàn)象[11]，這在一定程度上影響了神經(jīng)干細胞移植在臨床治療神經(jīng)病理性疼痛中的應(yīng)用。鑒于自體神經(jīng)干細胞獲取困難，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注分布廣泛而易于獲取的間充質(zhì)干細胞。

分類 優(yōu)點 現(xiàn)存問題 治療效果 參考文獻神經(jīng)干細胞(胚胎誘導(dǎo)的神經(jīng)干細胞；成體神經(jīng)干細胞)神經(jīng)系統(tǒng)同源；主要分化為星形膠質(zhì)細胞，分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子；供體細胞來源困難；需要體外誘導(dǎo)；維持分化潛能需要特殊條件；改善運動功能；緩解痛覺超敏； [8～14]間充質(zhì)干細胞(骨髓間充質(zhì)干細胞；脂肪組織源性干細胞；臍帶間充質(zhì)干細胞；)供體來源較易；可自體移植；移植方式靈活；易于體外擴增；低免疫原性，高組織相容性；需要一定條件維持定向分化；改善運動功能；緩解機械痛敏和熱痛敏；抑制炎癥反應(yīng)；[17～32]誘導(dǎo)的多能干細胞 避免倫理問題；可自體移植； 基因突變；基因編輯效率； 緩解慢性疼痛； [33,34]

2.間充質(zhì)干細胞在神經(jīng)病理性疼痛治療中的作用

間充質(zhì)干細胞來源于胚胎發(fā)育早期的中胚層，在體內(nèi)或體外特定的條件下可誘導(dǎo)分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織。同時，間充質(zhì)干細胞也可從不同來源的組織中分離出來，包括骨髓、臍帶、胎盤、脂肪組織、牙髓、胎兒肝臟、肺等。在某些特殊情況下，間充質(zhì)干細胞有轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細胞的潛力[17～19]。最具代表性的間充質(zhì)干細胞是骨髓間充質(zhì)干細胞和脂肪間充質(zhì)干細胞。有學(xué)者認為，脂肪間充質(zhì)干細胞是由骨髓間充質(zhì)干細胞遷移至脂肪組織而成，因而這兩種間充質(zhì)干細胞表型差異甚微[20]。此外，其他類型間充質(zhì)干細胞，如臍帶血間充質(zhì)干細胞和羊膜間充質(zhì)干細胞也受到廣泛關(guān)注。

（1）骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow MSC,BMSC)：骨髓由骨髓實質(zhì)（造血成分）和骨髓基質(zhì)（血管成分）組成。其中，骨髓實質(zhì)包含造血干細胞和造血祖細胞，骨髓基質(zhì)包含多種非造血祖細胞。骨髓的間充質(zhì)干細胞可以從造血細胞中分離出來，并可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞和星形膠質(zhì)細胞。在體外培養(yǎng)條件下，將骨髓間充質(zhì)干細胞擴增104倍，其多項分化潛能依舊不受影響。在以嚙齒類動物為模型的研究中，骨髓間充質(zhì)干細胞可緩解機械性損傷所致的坐骨神經(jīng)痛[21]，和非機械性糖尿病周圍神經(jīng)病變導(dǎo)致的病理性神經(jīng)痛[22]。研究表明，骨髓間充質(zhì)干細胞不僅能在一定程度上緩解神經(jīng)病理性疼痛的癥狀，還能調(diào)節(jié)神經(jīng)損傷相關(guān)炎癥反應(yīng)[23]，通過下調(diào)促炎因子水平，激活抗炎因子表達[24]，打破神經(jīng)炎癥反應(yīng)的惡性循環(huán)，緩解神經(jīng)病理性疼痛的病程進展。

骨髓間充質(zhì)干細胞的另一優(yōu)點在于移植方式的靈活性。相關(guān)動物模型的移植方法包括側(cè)腦室輸注[25]、鞘內(nèi)輸注[26]、尾靜脈注射[27]、原位移植[28]等。且無論通過何種方法進行移植，人類來源的骨髓間充質(zhì)干細胞均能減少神經(jīng)病理性疼痛模型鼠循環(huán)系統(tǒng)中炎癥因子水平，并在受損的脊髓或外周神經(jīng)周圍富集，緩解機械痛敏及熱痛敏癥狀。更值得注意的是，有研究顯示，骨髓間充質(zhì)干細胞的治療效果可持續(xù)至移植術(shù)后三個月[27]。研究者還通過移植前對骨髓基質(zhì)干細胞亞型的篩選，提高移植干細胞對炎癥因子的抑制程度，更加有效的緩解疼痛水平。與此同時，相對單一的細胞亞型保障了干細胞移植治療的安全性[29]。

（2）脂肪組織源性干細胞(adipose tissue derived MSC, ASC)：脂肪組織源性干細胞位于皮下脂肪組織，其優(yōu)勢在于獲取這些細胞所造成的創(chuàng)傷更小，更易進行于自體移植而無需外源供體，這最大程度的降低了移植物與宿主的組織不相容性。新近研究顯示，人類來源的脂肪組織源性干細胞可以有效緩解小鼠神經(jīng)病理性疼痛癥狀[30]。研究收集吸脂整形手術(shù)捐獻者的脂肪組織，在體外擴增后提取脂肪組織源性干細胞，通過鼠尾靜脈移植給坐骨神經(jīng)痛模型小鼠，并改善其病理性神經(jīng)痛的癥狀。該研究不僅證實脂肪組織源性干細胞治療神經(jīng)病理性疼痛的安全性和有效性，還首次提出優(yōu)化的治療方案，即在第一次干細胞移植治療效果開始減退時，進行第二次補充性移植，能夠產(chǎn)生更加快速、持久的治療效果[30]。脂肪組織源性干細胞除了低免疫原性的優(yōu)勢，還具有高免疫調(diào)節(jié)性的特點[30]，不少研究指出脂肪組織源性干細胞在治療神經(jīng)病理性疼痛中顯示出有效的抗炎效果[30]，而神經(jīng)炎癥反應(yīng)在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[31]。這些特性使得脂肪組織源性干細胞在神經(jīng)病理性疼痛的治療中具有很大的潛力。

（3）臍帶間充質(zhì)干細胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, UCMSC)：臍帶間充質(zhì)干細胞是另一類易于獲取的干細胞來源。人類新生兒臍帶包含兩條臍動脈和一條臍靜脈，共同包裹在一個特殊的被稱為Wharton' s jelly的粘液結(jié)締組織中，并由羊膜上皮覆蓋。通過不同的方法，間充質(zhì)干細胞可從臍帶組織的不同間隔中分離出來。臍帶間充質(zhì)干細胞擁有與胚胎干細胞相似的基因表達譜系其收集方法更符合倫理要求。臍帶間充質(zhì)干細胞不僅具有比骨髓間充質(zhì)干細胞更快的自我更新速度，還有其他諸多吸引人的優(yōu)勢，包括：①采集過程的非侵入性；②臍帶間充質(zhì)干細胞不僅可供異體移植，還可長期保存做自體移植；③相對其他來源的間充質(zhì)干細胞，臍帶間充質(zhì)干細胞移植感染率較低；④臍帶間充質(zhì)干細胞在宿主體內(nèi)惡變風(fēng)險相對較低；⑤低免疫原性；⑥良好的免疫抑制作用；⑦最后，也是最具有吸引力的一點，臍帶間充質(zhì)干細胞具有多潛能性。目前尚不清楚何種隔間來源的臍帶間充質(zhì)干細胞最適于神經(jīng)病理性疼痛的治療，但研究表明臍帶間充質(zhì)干細胞移植有益于脊髓損傷大鼠傷口愈合和運動恢復(fù)。也有報道指出臍帶間充質(zhì)干細胞移植對疼痛癥狀的緩解作用有限[32]，不同研究結(jié)果的差異可能與干細胞移植后分化為不同亞型相關(guān)。臍帶間充質(zhì)干細胞移植后定向分化的調(diào)控仍需進一步研究。

3.誘導(dǎo)的多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)

iPSCs是通過人工誘導(dǎo)非多能性細胞表達某種特定基因得到的多能干細胞。iPSCs和天然多功能干細胞在很多方面具有相似性，且同樣具有分化潛能。iPSC 不僅可以規(guī)避免疫排斥的風(fēng)險，還能避免使用胚胎干細胞帶來的倫理爭議?？捎糜谡T導(dǎo)iPSCs的基因組合包括：Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc組合，和Oct4、Sox2、Lin28、Nanog組合，研究發(fā)現(xiàn)通過病毒把它們一起轉(zhuǎn)入小鼠的成纖維細胞，可以誘導(dǎo)成纖維細胞重新回到胚胎干細胞狀態(tài)。目前誘導(dǎo)iPSCs的方法主要有3種：第一種是通過轉(zhuǎn)錄因子實現(xiàn)細胞關(guān)鍵信號的開閉，實現(xiàn)普通細胞轉(zhuǎn)化為干細胞；第二種是利用化學(xué)分子組合實現(xiàn)普通細胞轉(zhuǎn)化為干細胞。第三種是通過CRISPR激活系統(tǒng)靶向內(nèi)源基因Oct4和Sox2，精確重塑這兩個基因位點的表觀特征[33]。通過使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)靶向激活內(nèi)源Oct4或Sox2基因，可以成功實現(xiàn)體細胞多能性的誘導(dǎo)。目前已有研究將iPSCs用于慢性疼痛的治療，但用于治療神經(jīng)病理性疼痛的相關(guān)研究鮮有報道[34]。盡管iPSCs有諸多優(yōu)點，但需要研究者重視的是，病毒基因可能導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定，誘發(fā)基因突變，同時iPSC 的基因編輯效率尚有待提高。

四、干細胞移植相關(guān)問題及展望

近年來，干細胞作為治療神經(jīng)病理性疼痛的新方案引起了很多關(guān)注，越來越多的動物試驗證明的干細胞在緩解神經(jīng)病理性疼痛中的積極作用。相對于目前的臨床治療方法，干細胞治療的優(yōu)點在于：①治療周期短，單次移植治療就能緩解機械痛敏和熱痛敏的癥狀；②起效迅速并且療效持久[27]；③能在一定程度上緩解炎癥反應(yīng)，改善運動功能。而以往以藥物為基礎(chǔ)治療方案需要相對較長的起效時間和治療療程，常需要聯(lián)合用藥。聯(lián)合用藥增加了藥物相互作用的風(fēng)險，并可能增加病人的治療矛盾。其他治療方式則多涉及有創(chuàng)操作，單獨難以滿足治療需要，且可能存在復(fù)發(fā)。而干細胞在神經(jīng)病理性疼痛治療中的應(yīng)用不僅能夠控制疼痛癥狀，更可能作為一種神經(jīng)免疫及炎癥系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)因子，打破疾病發(fā)生發(fā)展過程中的惡性循環(huán)，改善神經(jīng)局部微環(huán)境并減輕全身炎癥反應(yīng)。

盡管干細胞移植具有上述積極的結(jié)果和優(yōu)勢，目前想實施一個成功的臨床干細胞移植仍有很多問題需要考慮。包括移植細胞的類型及來源、移植的方法和途徑、移植的劑量和濃度、移植后的干細胞的存活情況、移植的效率、移植細胞在宿主體內(nèi)的遷移情況，以及最終評判移植效果的標準。以移植方法為例，將干細胞移植到受損組織是最直接的方法，但有潛在的出血及二次損傷的風(fēng)險；而通過血液輸注的方法雖然簡單易行，但移植效率較低，且涉及到宿主免疫系統(tǒng)可能產(chǎn)生抗移植物反應(yīng)，或移植的細胞沒有遷移到需要治療的受損組織，而是隨血液循環(huán)抵達、滯留在其他組織，導(dǎo)致移植失敗甚至不良反應(yīng)和嚴重并發(fā)癥。比如，移植干細胞在宿主體內(nèi)的遷移問題一直備受爭議，盡管有研究表明通過血液移植的神經(jīng)干細胞[13]和間充質(zhì)干細胞[27]均能特異性的富集于神經(jīng)受損處而非機體其他組織，但細胞移植仍存在潛在危險性。已有研究證實肺組織對移植干細胞的首過消除效應(yīng)[35]，而肺在全身炎癥反應(yīng)中有極高的易感性，其清除異源移植物的同時，有可能造成自身損傷。一些研究嘗試通過增加移植干細胞數(shù)量的方法增加移植效率，但這可能引發(fā)另一些問題，如移植干細胞自主分泌的生物活性物質(zhì)可能對宿主產(chǎn)生影響，甚至發(fā)生移植物抗宿主反應(yīng)。此外，雖然移植的干細胞本身惡變的可能性不大，但移植干細胞能夠明顯抑制宿主自身的免疫反應(yīng)，這可能導(dǎo)致宿主罹患腫瘤的危險性增加[36]。

盡管目前干細胞移植在神經(jīng)病理性疼痛的治療方法應(yīng)尚需完善，多數(shù)報道表明干細胞移植的安全性及優(yōu)效性[29,30,37]。干細胞移植在神經(jīng)病理性疼痛的治療中充滿希望與挑戰(zhàn)，從實驗室到臨床，干細胞移植治療神經(jīng)病理性疼痛還有很多問題需要研究，但有希望成為安全、高效治療神經(jīng)病理性疼痛的新方法。