張秀梅 趙文平 劉星芳 黃志華 單熱愛,4△ 黃 誠(chéng)△

( 贛南醫(yī)學(xué)院 1第一臨床醫(yī)學(xué)院；2第一附屬醫(yī)院麻醉科；3生理學(xué)教研室；4疼痛醫(yī)學(xué)研究所，贛州 341000)

慢性炎癥痛在臨床中常見，在中國(guó)，遭受慢性疼痛困擾的人口達(dá)35.9%，嚴(yán)重影響病人的工作能力和生活質(zhì)量，給社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。目前臨床上一些鎮(zhèn)痛藥物在一定程度上能達(dá)到較好的鎮(zhèn)痛作用，但其中有一大部分病人并未得到足夠有效的鎮(zhèn)痛治療?；诖?，研究出更多治療慢性炎癥疼痛的藥物意義重大。

雷公藤紅素(celastrol, Cel)，是來(lái)源于雷公藤根皮的三萜類化合物，是雷公藤中最主要的活性成分之一[2]。研究發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素在抗炎、免疫抑制、抗腫瘤及神經(jīng)衰退性疾病等治療方面都表現(xiàn)出較好的療效[3]。在足底注射角叉菜膠致小鼠炎癥痛模型中，給予Cel腹腔注射治療能明顯改善小鼠的機(jī)械痛敏行為[4]。在CFA誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠模型中，腹腔給予Cel(1 mg/kg)可明顯減輕大鼠足底腫脹，關(guān)節(jié)組織HE染色及免疫組化結(jié)果顯示經(jīng)Cel治療后可消除炎癥浸潤(rùn)，減少免疫細(xì)胞增殖。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明Cel可明顯抑制NF-κB的激活，減少IL-1β、IL-6及TNF-α的分泌[4,5]。研究表明，脊髓膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)在慢性疼痛中發(fā)揮重要作用[6,7]，Cel能否通過(guò)抑制神經(jīng)炎癥緩解慢性炎癥痛尚未見報(bào)道。

在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素對(duì)CFA誘發(fā)的慢性炎癥痛具有顯著的鎮(zhèn)痛作用，為此，進(jìn)一步深入研究雷公藤紅素對(duì)慢性炎癥痛的可能鎮(zhèn)痛分子機(jī)制。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

第一部分實(shí)驗(yàn)：SPF級(jí)健康雄性SD 大鼠 30只[購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物中心許可證號(hào)： SCXK（湘）2013-0004]，體重200±20 g，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物符合動(dòng)物倫理，按隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)均分成正常對(duì)照組、溶劑組(VEH, Vhicle)、Cel 0.25 mg/kg組、Cel 0.5 mg/kg組和Cel 1mg/kg組（分別用64% 、61% DMSO、50% DMSO助溶），每組大鼠于CFA造模后1、3、7、10、14 d進(jìn)行熱輻射閾值測(cè)定及足趾腫脹度測(cè)定，據(jù)測(cè)定結(jié)果篩選出最佳Cel濃度。

第二部分實(shí)驗(yàn)：在第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上108只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、溶劑組(VEH)和Cel 1 mg/kg組，造模后的第1、3、7、14 d每組各取12只取材處理。

2.慢性炎癥痛模型制備

大鼠乙醚吸入麻醉后酒精棉球消毒左后足底皮膚，模型組及Cel 1 mg/kg組用1 ml注射器左足底皮下注射0.1 ml CFA。正常對(duì)照組左后足底注射與CFA同體積的生理鹽水。造模后10 h正常對(duì)照組、VEH組及Cel 1 mg/kg組分別給予0.1 ml/100 g生理鹽水、二甲基亞砜(DMSO) 及Cel腹腔注射給藥，每天給藥一次，持續(xù)給藥14 d。

3.輻射熱誘發(fā)痛的撤足潛伏期(paw withdrawal latency, PWL) 測(cè)定

實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求的溫度為24±1℃，濕度為55%～65%。事先調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度，設(shè)定最長(zhǎng)熱輻射時(shí)間為20 s，以免灼傷大鼠足底皮膚。行為測(cè)試前，將大鼠置于薄玻璃板上，蓋以透明的有機(jī)玻璃罩。大鼠適應(yīng)環(huán)境15 min安靜后，利用PL-200熱刺痛儀（成都泰盟軟件有限公司）照射大鼠后肢足底正中間，儀器自動(dòng)記錄從開始照射到抬足之間的時(shí)間，即為此足的縮足潛伏期。讀數(shù)精確到0.01 s，每只腳重復(fù)3次，每次間隔5 min，取平均值。

4.后足容積測(cè)定

實(shí)驗(yàn)前用記號(hào)筆繞鼠踝關(guān)節(jié)一圈做好標(biāo)記，用大鼠固定器固定好大鼠，暴露出雙后肢，用足趾容積測(cè)量?jī)x（PV-200成都泰盟軟件有限公司）測(cè)量后足容積，將測(cè)量燒杯裝滿130 ml左右清水，放在工作面上。開始測(cè)量前先對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行清零，完成清零后將待測(cè)鼠的后足浸入測(cè)量燒杯的清水中至標(biāo)記處，待提示“按腳踏開關(guān)確認(rèn)數(shù)據(jù)”時(shí)，即可立即踩腳踏開關(guān)，此時(shí)便得到測(cè)量數(shù)據(jù)。

5.Western blot方法檢測(cè)HMGB1、NF-κB及COX-2蛋白的表達(dá)

將手術(shù)側(cè)大鼠脊髓加裂解液于勻漿器中進(jìn)行冰上勻漿，12 000 r/min，5 min，4 ℃離心，BCA法行蛋白定量，取40 μg總蛋白加入上樣緩沖液煮沸變性，經(jīng)10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)移至PVDFA膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后，一抗4℃過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑孵育1 min后，進(jìn)行超高靈敏度化學(xué)成像發(fā)光儀照相，用Image Lab 3.0軟件測(cè)定灰度值，與其相應(yīng)β-actin比較后，將對(duì)照組值定為1，計(jì)算其余組相對(duì)值。

6.q-PCR 法 檢 測(cè) HMGB1、GFAP、IL-1β 及TNF-α的mRNA的表達(dá)

采用A SYBR Select Master Mix試劑盒步驟提取總RNA并配制20 μl逆轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄循環(huán)：65℃，5 min；37℃，2 min；37℃，10 min；5個(gè)循環(huán)，70℃，15 min。PCR反應(yīng)引物序列由上海生工生物工程公司合成。HMGB1,Forward GAACAACACTGCTGCGGATG, Reverse CCCTTTTTCGCTGCATCAGG.GFAP, Forward-ACCTCACAGACGTTGCTTCC, ReverseGCCTCTCCAAGGACTCGTTC.IL-1β, ForwardGGGATGATGACGACCTGCTA, ReverseCCACTTGTTGGCTTATGTTCTG.TNF-α, ForwardAGAACTCCAGGCGGTGTCT,ReverseGAGCCCATTTGGGAACTTCT.GAPDH, ForwardCAGCCGCATCTTCTTGTGC,ReverseGGTAACCAGGCGTCCGATA。采用qPCR法進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：預(yù)變性(95℃，10 min)；40 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(95℃，10 s；61℃，20 s；72℃，25 s)；溶解(72℃ -95℃，0.5℃，10 s/次 )。每組重復(fù)檢測(cè)3次。采用2^-ΔΔCt法分析HMGB1、IL-1β、TNF-α及GFAP的mRNA表達(dá)水平。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以Prism 5.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；計(jì)量資料以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示。結(jié)果數(shù)據(jù)采用two-way ANOVA和Bonferroni' s post hoc 檢驗(yàn)，重測(cè)資料的分析采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.Cel對(duì)慢性炎癥痛大鼠PWL、足趾腫脹度的影響

造模后VEH組及Cel組與正常對(duì)照組相比PWL均明顯降低(P＜0.05)，給予Cel治療后，觀察到Cel 1 mg/kg在治療后1、3、7、10、14 d能明顯提高上述模型大鼠造模側(cè)后足PWL值(P＜0.001)，并且明顯減輕大鼠造模側(cè)足腫脹度(P＜0.001、P＜0.01、P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01，見圖 1、2)。

2.Cel對(duì)慢性炎癥痛大鼠HMGB1、COX-2蛋白表達(dá)及NF-κB的磷酸化水平的影響

與正常對(duì)照組比較，在造模后第3 d VEH組造模側(cè)脊髓背角中HMGB1、COX-2蛋白表達(dá)明顯增多及NF-κB的磷酸化水平增高，并持續(xù)增高至第14 d；與VEH組相比，Cel 1 mg/kg組造模側(cè)脊髓背角中HMGB1、COX-2蛋白表達(dá)明顯減少及NF-κB的磷酸化水平降低（P＜0.05，見圖3～5）。

3.Cel對(duì)慢性炎癥痛大鼠HMGB1、GFAP、IL-1β及TNF-α的mRNA的影響

與Ctrl比較，在造模后第3 d VEH組造模側(cè)脊 髓 背 角中 HMGB1、IL-1β、TNF-α及 GFAP的mRNA表達(dá)明顯增多，并持續(xù)增高至第14 d；與VEH組相比，Cel 1 mg/kg組造模側(cè)脊髓背角中HMGB1、IL-1β、TNF-α及GFAP的 mRNA表達(dá)明顯減少（見圖6）。

討 論

雷公藤紅素藥理活性廣泛[8]，研究表明，在多種動(dòng)物模型雷公藤紅素表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗炎活性，其中包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[9]、慢性退行性疾病[10]等。在本研究中發(fā)現(xiàn)CFA誘導(dǎo)慢性炎癥痛通過(guò)激活HMGB1/ NF-κB 信號(hào)通路，上調(diào)脊髓中HMGB1、NF-κB的表達(dá)。Cel 1mg/kg能明顯提高慢性炎癥痛大鼠的撤足閾值，明顯緩解局部炎癥，顯著減輕患足腫脹度，并且抑制HMGB1/NF-κB通路，減少促炎介質(zhì)，如IL-1β、TNF-α、COX-2的表達(dá)。

圖1 Cel對(duì)慢性炎癥痛大鼠PWL的影響(n=6,±SD)***P＜0.001，與Ctrl組相比 ；#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001，與 VEH 組相比Fig.1 Effect of Cel on paw withdrawal latency(PWL)in rats with chronic inflammatory pain(n=6,±SD)***P＜0.001, compared with Ctrl group; #P＜0.05,##P＜0.01 , ###P＜0.001, compared with group VEH.

圖2 Cel對(duì)慢性炎癥痛大鼠ΔEdema的影響(n=6,±SD)#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001，與 VEH 組相比Fig.2 Effect of Cel on foot swelling(ΔEdema) in rats with chronic inflammatory pain(n=6,±SD)#P＜0.05, ##P＜0.01, ###P＜0.001, compared with group VEH.

圖3 Western blots檢測(cè)各組大鼠造模側(cè)脊髓背角HMGB1的表達(dá)(n=8,±SD)A：Western blots檢測(cè)各組HMGB1的表達(dá)B：Western blots結(jié)果直方圖分析*P＜0.05，***P＜0.001，VEH 組第 1，3，7，14 d分別與Ctrl組1，3，7，14 d相比；#P＜0.05，##P＜0.01，Cel組第 1，3，7，14 d 分別與 VEH組1，3，7，14 d相比Fig.3 Western blots showing expression of HMGB1 in the rat dorsal horn(n=8,±SD)A: Western blots showing expression of HMGB1 in each group.B: Quantification of Western blot data.*P＜0.05, ***P＜0.001, the 1, 3, 7, 14 d of VEH group were respectively compared with Ctrl group;#P＜0.05, ##P＜0.01, the 1, 3, 7, 14 d of Cel group were respectively compared with group VEH.

圖4 Western blots檢測(cè)各組大鼠造模側(cè)脊髓背角NF-κB的磷酸化情況(n=9,±SD)A：Western blots檢測(cè)各組NF-κB的磷酸化情況B：Western blots結(jié)果直方圖分析*P＜0.05，VEH組第1，3，7，14 d分別與Ctrl組1，3，7，14 d 相比；#P＜0.05，##P＜0.01，Cel組第 1，3，7，14 d分別與VEH組1，3，7，14 d相比Fig.4 Western blots showing the phosphorylation level of NF-κB in the rat dorsal horn(n=9,±SD)A: Western blots showed the phosphorylation level of NF-κB in each group.B: Quantification of Western blot data.*P＜0.05, the 1, 3, 7, 14 d of VEH group were respectively compared with Ctrl group; #P＜0.05,##P＜0.01, the 1, 3, 7, 14 d of Cel group were respectively compared with group VEH.

圖5 Western blots檢測(cè)各組大鼠造模側(cè)脊髓背角COX-2的表達(dá)(n=7,±SD)A：Western blots檢測(cè)各組COX-2的表達(dá)B：Western blots結(jié)果直方圖分析*P＜0.05，**P＜0.01，VEH 組 第 1，3，7，14 d分 別 與 Ctrl組 1，3，7，14 d相 比；#P＜0.05，###P＜0.001，Cel組第 1，3，7，14 d 分別與 VEH組1，3，7，14 d相比Fig .5 Western blots showed the expression of COX-2 in rat dorsal horn in every group at different time(n=7,±SD)A: Western blots showed the expression of COX-2 in each group.B: Quantification of Western blot data.*P＜0.05, **P＜0.01, the 1, 3, 7, 14 d of VEH group were respectively compared with Ctrl group; #P＜0.05,###P＜0.001, the 1, 3, 7, 14 d of Cel group were respectively compared with group VEH.

慢性炎癥痛的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，當(dāng)外周組織發(fā)生炎癥或損傷時(shí)，為應(yīng)對(duì)損傷，機(jī)體啟動(dòng)外周、中樞固有免疫應(yīng)答，同時(shí)當(dāng)外周慢性疼痛發(fā)生時(shí)，脊髓作為疼痛傳遞的中轉(zhuǎn)站，為應(yīng)對(duì)損傷將發(fā)生一系列病理生理變化，其中包括膠質(zhì)細(xì)胞（如星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞）增生及局部促炎因子的產(chǎn)生，促炎因子對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行激活[11～13]。激活的膠質(zhì)細(xì)胞將產(chǎn)生更多的傷害感受介質(zhì)，如ATP、細(xì)胞因子及趨化因子，這些膠質(zhì)遞質(zhì)將對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行敏化，促進(jìn)中樞敏化的發(fā)生[14]。促炎細(xì)胞因子，諸如IL-1β、TNF-α，參與神經(jīng)炎癥的發(fā)生和發(fā)展，神經(jīng)炎癥對(duì)慢性疼痛的啟動(dòng)和維持起著至關(guān)重要的作用[15]。

圖6 qPCR檢測(cè)各組大鼠造模側(cè)脊髓背角HMGB1 、IL-1β、TNF-α及GFAP mRNA的表達(dá)(n=4,±SD)*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，VEH 組第 1，3，7，14 d 分別與 Ctrl組 1，3，7，14 d 相比；#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001，Cel組第 1，3，7，14d分別與VEH組1，3，7，14 d相比Fig.6 qPCR showing expression of HMGB1、IL-1β、TNF-α and GFAP mRNA in rat dorsal horn(n=4,±SD)*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001, the 1, 3, 7, 14 d of VEH group were respectively compared with Ctrl group;#P＜0.05, ##P＜0.01, ###P＜0.001, the 1, 3, 7, 14 d of Cel group were respectively compared with group VEH.

在細(xì)胞損傷或壞死時(shí)，高遷移率族蛋白1(HMGB1)能從細(xì)胞被動(dòng)分泌，也可由單核/巨噬細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞在致炎細(xì)胞因子刺激下被動(dòng)分泌[11]。研究證實(shí)，在慢性疼痛模型中，脊髓中HMGB1被激活，通過(guò)與NF-κB相互作用，從而促發(fā)下游一系列促炎細(xì)胞因子的釋放，同時(shí)釋放的細(xì)胞因子反過(guò)來(lái)又促進(jìn)HMGB1的釋放，從而形成HMGB1與炎癥因子之間的正反饋循環(huán)軸，調(diào)節(jié)脊髓興奮性突觸傳遞及疼痛應(yīng)答，參與慢性炎癥痛的發(fā)生與發(fā)展[16～19]。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組HMGB1、NF-κB表達(dá)水平低，VEH組HMGB1至造模后第3 d表達(dá)明顯升高并維持至整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。但經(jīng)Cel治療后，脊髓HMGB1、NF-κB蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)，與此同時(shí)，脊髓IL-1β、TNF-α、COX-2、GFAP有一致的變化趨勢(shì)，提示在CFA造模大鼠脊髓背角，HMGB1被激活，通過(guò)與NF-κB相互作用，從而促發(fā)下游一系列促炎細(xì)胞因子的釋放，同時(shí)釋放的細(xì)胞因子反過(guò)來(lái)又促進(jìn)HMGB1的釋放，可能是慢性炎癥痛的機(jī)制之一

綜上所述，本研究初步探究了Cel治療慢性炎癥痛的可能分子機(jī)制，預(yù)示HMGB1/ NF-κB可能為其治療靶點(diǎn)之一。推測(cè)Cel通過(guò)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，抑制HMGB1/ NF-κB信號(hào)通路從而抑制神經(jīng)炎癥為其治療慢性炎癥痛的機(jī)制之一，但本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行造模大鼠鞘內(nèi)給予HMGB1激動(dòng)劑，對(duì)其更深入的鎮(zhèn)痛機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。