劉守川，劉 杰，王志紅，薛 瑞，王洋洋，肖亞朋

（洛陽中科基因檢測診斷中心有限公司，河南 洛陽 471000）

2018年5月洛陽某豬場保育豬出現(xiàn)咳嗽，喘氣、關(guān)節(jié)腫大等癥狀，部分豬有下頜、眼臉腫大的現(xiàn)象。對1頭發(fā)病豬進(jìn)行剖檢，取病變組織進(jìn)行病原學(xué)鑒定，結(jié)果檢測出溶血性大腸桿菌、豬鏈球菌。結(jié)合臨床癥狀、病理變化和實(shí)驗(yàn)室診斷，確診為豬水腫病和豬鏈球菌病混合感染。

1 材料與方法

1.1 臨床情況及取樣

圖1 剖檢圖片

某豬場保育豬出現(xiàn)咳嗽、腹式呼吸、關(guān)節(jié)腫大、下頜和眼臉腫大等癥狀，發(fā)病率40%，死亡率30%。選取1頭有下頜、眼臉腫大、腹式呼吸并伴跛行等癥狀的病豬進(jìn)行剖檢。剖檢可見心包積液增多、呈淡的清色，肺臟邊緣有黃色纖維素性滲出物，肺間質(zhì)增寬，腎臟腫大，腸道水腫。根據(jù)臨床癥狀及病理情況分別采集肺臟等組織進(jìn)行細(xì)菌分離。

1.2 主要培養(yǎng)基及試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、革蘭氏染色試劑、DNA Taq酶、dNTPs、DNAmarker、細(xì)菌微量生化管及藥敏紙片。

1.3 方法

1．3．1 細(xì)菌分離

無菌采取病死豬肺臟，分別接于血平板和TSA+血清+NAD培養(yǎng)基，37 ℃，厭氧培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，挑取單個菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，純化培養(yǎng)后菌株進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢和常規(guī)細(xì)菌生化試驗(yàn)。

1．3．2 生化鑒定

選取生化鑒定試管進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1．3．3 16S rDNA 克隆測序及序列分析

挑取單個菌落進(jìn)行16S rDNA測序分析，引物為實(shí)驗(yàn)室常用引物：16S-F1500：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，16S-R1500：5’-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT，擴(kuò)增出的目的片段大小約為1 500 bp，該引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

PCR采 用50μL反 應(yīng) 體系， 即 10×PCR Buffer 5．0μL、dNTP4．0μL、DNA Taq 酶 1．0μL，16S-F1500/16S-R1500 引 物 各 2．0μL，DNA 模 板 4．0μL，ddH2O 32．0μL。PCR反 應(yīng) 條 件 為：95 ℃ 5 min，94 ℃ 60 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s， 共 30 個 循 環(huán)；72 ℃10 min。取部分 PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1．5% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，剩余產(chǎn)物送北京英濰捷基公司測序，并用MEG7．0進(jìn)行序列分析。

1．3．4 藥敏試驗(yàn)

挑取疑似單個菌落接種于TSB+血清培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫?fù)u床中，培養(yǎng)5～6 h，取100μL均勻涂布于含血清的MH培養(yǎng)基上。用紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B法）[1]進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選取頭孢噻呋、阿莫西林、甲砜霉素、硫酸黏菌素、桿菌肽、阿米卡星、恩諾沙星、卡那霉素、慶大霉素、多西環(huán)素和氟苯尼考為試驗(yàn)藥物，37 ℃培養(yǎng)16～18 h后，記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑大小，根據(jù)說明書敏感和耐藥性的最小抑菌圈直徑判定菌株對所選藥物的敏感程度。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

細(xì)菌初次分離時平板上有兩種菌落形態(tài)，分別命名為20180630和20180725，挑取單個菌落進(jìn)行純化后，在血平板上，20180630為小而透明菌落，β溶血，革蘭氏染色陽性球菌，呈鏈狀，如圖2和圖3；20180725為灰色大菌落，β溶血，呈黏液狀，革蘭氏染色陰性桿菌，如圖4和圖5。

2.2 細(xì)菌 16S rDNA 鑒定結(jié)果

利 用 16S rDNA 檢 測 引 物 擴(kuò) 增出大小為1．5 kb左右的目的片段，如圖6。對測序結(jié)果用DNA STAR軟件處理，并與NCBI中已發(fā)表的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比較，選取同源性最高菌株的16S rRNA基 因 序 列， 采 用 MEG7．0軟 件 進(jìn)行多重序列比對分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖7，從結(jié)果可以看出，20180630 與 streptococcus suis S735同 源 性 為 99．65%， 證 明 該菌 為 豬 鏈 球 菌。20180725與Escherichia coli ATCC 11775 同源性為99．36%，證明該菌為大腸桿菌。

2.3 生化鑒定結(jié)果

從 表1和 表2不 難 看 出 ，201807630發(fā)酵乳糖、菊糖、棉子糖、海藻糖和水楊苷，不發(fā)酵七葉苷、甘露醇和山梨醇；20180725發(fā)酵棉子糖、蜜二糖、甘露醇，對山梨醇、肌醇，吲哚、VP、苯丙氨酸、檸檬酸鹽、硫化氫呈陰性，產(chǎn)生尿素酶，不產(chǎn)生鳥氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶，能運(yùn)動。

圖2 20180630菌落形態(tài)

圖3 20180630革蘭氏染色鏡檢（1 000×）

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

挑取分離到的20180630和20180725進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，20180630敏感藥物為頭孢噻呋、阿莫西林、甲砜霉素、桿菌肽、恩諾沙星、氟苯尼考；20180725敏感藥物為硫酸黏菌素和阿米卡星。

3 總結(jié)

本次檢測結(jié)果為大腸桿菌和豬鏈球菌混合感染，從臨床癥狀和分離到的細(xì)菌的致病機(jī)理判斷，此次應(yīng)該是豬鏈球菌繼發(fā)大腸桿菌感染，分離到的豬鏈球菌在后續(xù)實(shí)驗(yàn)室鑒定中排除2型豬鏈球菌的可能。豬鏈球菌產(chǎn)生透明質(zhì)酸酶造成血管中纖維蛋白滲出，附著于臟器表面。豬鏈球菌的感染造成動物機(jī)體抵抗力下降，引起大腸桿菌感染[2]。

臨床上能引起豬纖維素性滲出癥狀的細(xì)菌病有很多，常見的有豬肺疫、傳

圖4 20180725菌落形態(tài)

圖5 20180725革蘭氏染色鏡檢（1 000×）

圖6 細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果

圖7 16S rDNA基因全序列系統(tǒng)發(fā)育樹

表 1 20180630 生化鑒定結(jié)果

表 2 20180725 生化鑒定結(jié)果

表 3 20180630 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

說明：S為敏感，R為耐藥，I為中介。下表同。染性胸膜肺炎放線桿菌病、副豬嗜血桿菌病和豬鏈球菌病等[3]，需要對其進(jìn)行簡單了解以便進(jìn)行快速區(qū)分，并且有助于實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌分離。本次臨床癥狀主要表現(xiàn)為纖維素性滲出，關(guān)節(jié)腫，肺部有病變，傳染性胸膜肺炎放線桿菌和豬肺疫一般很少能引起關(guān)節(jié)腫的臨床癥狀，另外傳染性胸膜肺炎放線桿菌纖維素性滲出主要集中在胸腔，副豬嗜血桿菌雖然引起纖維素性滲出和關(guān)節(jié)腫，但是副豬嗜血桿菌病一般在肺部組織很少有病變出現(xiàn)，表現(xiàn)的都較為健康[4]。

表 4 20180725 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

能夠引起動物發(fā)病的大腸桿菌，世界上公認(rèn)的有5種，分為不同的血清型，分別為腸致病性大腸桿菌（EPEC）、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）、腸聚集黏附性大腸桿菌（EAEC）[5]，本次分離的溶血性大腸桿菌與ATCC 11775的同源性為99．36%，ATCC 11735為致病性大腸桿菌（EPEC），但是在實(shí)際臨床情況中豬群并未表現(xiàn)出大規(guī)模的水腫癥狀，所以水腫病可能為個例，但在實(shí)際用藥過程中仍需要防范大腸桿菌病的暴發(fā)。因?yàn)榇竽c桿菌是環(huán)境中或動物機(jī)體常見菌群，所以在臨床分離細(xì)菌時容易忽略大腸桿菌，尤其是實(shí)驗(yàn)室人員在不知道臨床癥狀的情況下，容易忽略大腸桿菌作為致病因素的情況，所以在實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌分離后需要與臨床癥狀進(jìn)行印證，防止出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室病原與臨床癥狀不一致的情況出現(xiàn)。本次分離到的大腸桿菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性，在實(shí)際用藥過程中應(yīng)注意抗生素的使用方式。

藥敏結(jié)果對所分離的兩種細(xì)菌有不同的表現(xiàn)，實(shí)際用藥建議使用頭孢噻呋和阿莫西林。阿米卡星使用時，應(yīng)注意豬群情況，防止加重臨床癥狀，根據(jù)本次細(xì)菌分離情況，病原主要是細(xì)菌病，在使用抗生素的過程中，需要添加黃芪多糖[6]，防止陰性桿菌釋放內(nèi)毒素造成動物應(yīng)激死亡。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室提供的建議，養(yǎng)殖場在使用頭孢噻呋和阿莫西林后，臨床癥狀明顯減輕。