趙 昭， 史慧娟， 張 楠，肖國華， 劉存歧， 金 磊

(1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002； 2.河北大學(xué)博物館，河北保定 071002；3.河北省海洋與水產(chǎn)科學(xué)研究院，河北秦皇島 066200)

浮萍在世界上主要有多根紫萍屬(Spirodela)、少根紫萍屬(Landoltia)、浮萍屬(Lemna)、扁平無根萍屬(Wolffiella)、蕪萍屬(Wolffia)5屬40種[1]，而在我國主要有3屬7種[2]，是一種世界廣泛分布、在人工濕地建設(shè)較好的水生植物[3]，主要生活在靜止或流動緩慢的淡水中，能夠降解污染物，吸收氮磷、降解重金屬[4]。浮萍是一種形態(tài)高度退化的高等被子植物，僅有葉狀體和根，其中葉狀體是浮萍進行光合作用的主要器官，而休眠體是浮萍在生長周期過程中重要的生命階段，體積小、沒有氣孔、細(xì)胞壁厚、淀粉含量高[5]，在形態(tài)學(xué)上與葉狀體有很大不同，能夠使浮萍抵御外界的惡劣環(huán)境[6]。在自然環(huán)境中，浮萍大多數(shù)種類能夠在夏季末期產(chǎn)生一種休眠體，并沉降到水體底部不再生長，當(dāng)經(jīng)過寒冷的冬天刺激及春天溫度升高時，其能夠浮上水面并利用儲藏的淀粉發(fā)芽而生長成葉狀體[7]。在實驗室環(huán)境中，低溫、脫落酸(ABA)及N、S、P等營養(yǎng)元素的缺乏也能誘導(dǎo)浮萍形成休眠體[6]。浮萍又是一種潛在的能源植物，生長速度快，每2～3 d可實現(xiàn)生物量翻倍[8]，最高的生長速度可達(dá)到干質(zhì)量12.4 g/(m2·d)，而浮萍在不同的生長環(huán)境下淀粉含量差異較大，可占到干質(zhì)量的3%～75%[5，9]。浮萍可經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，產(chǎn)量達(dá)到6.42×103L/hm2，比同等條件下玉米生產(chǎn)的乙醇產(chǎn)量高50%[10]，與玉米、甘薯等傳統(tǒng)能源植物相比，浮萍還可以凈化豬場污水和重金屬污染的水體，不會占用大量耕地，不會造成糧食危機[2，11]。

目前，有關(guān)植物淀粉合成和降解途徑的研究較多，而有關(guān)浮萍在形成休眠體過程中淀粉的積累機制研究相對較少。有研究表明，植物葉片通過光合作用產(chǎn)生暫時性淀粉，并通過降解產(chǎn)生蔗糖，提供淀粉合成的原材料；蔗糖在蔗糖合成酶的作用下分解為果糖、UDP-葡萄糖，進一步形成6-磷酸葡萄糖或1-磷酸葡萄糖；6-磷酸葡萄糖在ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase)的作用下形成葡聚糖鏈，在淀粉合成酶和淀粉分支酶的作用下形成直鏈淀粉和支鏈淀粉，AGPase是淀粉合成的限速酶[12]，其活性受到抑制將導(dǎo)致淀粉合成途徑部分和全部終止，其活性或表達(dá)量的升高將會促進淀粉的合成[13-14]。淀粉的分解途徑主要是在α、β-淀粉酶和糖化酶的作用下，水解直鏈淀粉和支鏈淀粉形成葡萄糖[15]。本試驗采用ABA誘導(dǎo)紫萍(S.polyrrhiza)形成休眠體，研究其淀粉合成和降解途徑相關(guān)酶的活性及葉綠素含量變化，以揭示浮萍休眠體形成過程中影響淀粉含量變化的因素，為其進一步開發(fā)利用奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 休眠體與葉狀體的獲得

紫萍NJ016取自四川大學(xué)荷花池，1% NaClO處理60～90 s，無菌水清洗2～3次；轉(zhuǎn)移到無菌營養(yǎng)液中，使用Wang等描述的方法[5]誘導(dǎo)紫萍形成休眠體并進行收集；無菌條件下，將休眠體培養(yǎng)在含100 mL霍格蘭氏(Hoagland’s)營養(yǎng)液的250 mL鄂倫麥爾(Erlenmeyer)三角瓶中，置于溫度為 (25±1) ℃、光照度為7 000 lx、光—暗周期為16 h—8 h的溫室中培養(yǎng)7 d，即得由休眠體產(chǎn)生的第1代大小相同的葉狀體。

1.2 試驗處理

將葉狀體在無菌條件下轉(zhuǎn)接到含1%蔗糖、pH值為5.8的Hoagland’s營養(yǎng)液中，置于溫度為(25±1) ℃、光照度為 7 000 lx、光—暗周期為16 h—8 h的溫室中培養(yǎng)3 d，加入 1 μmol/L ABA，分別收集ABA處理前(0 d)及ABA處理1、2、3、5 d時的葉狀體。ABA處理7 d時，可從葉狀體中分離收集到休眠體。

1.3 測定內(nèi)容與方法

1.3.1 淀粉含量 將干燥葉狀體或休眠體進行研磨，取干粉0.3 g，加入3 mL 6 mol/L HCl，沸水浴處理2 h，用6 mol/L HCl或6 mol/L KOH調(diào)節(jié)pH值到7.0±0.5；加入200 μL Pb(COOH)2沉淀蛋白，5 000 r/min離心5 min，取上清液，高效液相色譜法(HPLC法)測定葡萄糖含量，計算淀粉含量，公式[16]為：

淀粉含量=葡萄糖含量×0.909。

1.3.2 葉綠素含量 稱取葉狀體或休眠體鮮質(zhì)量1 g，加入丙酮、乙醇配比為1 ∶1的反應(yīng)液萃取72 h，酶標(biāo)儀上分別測定波長為663、645 nm的吸光度，葉綠素濃度按照張憲政的方法[17]計算。

1.3.3 AGPase酶活性和α、β-淀粉酶活性

1.3.3.1 粗酶液的提取[18]稱取葉狀體或休眠體鮮質(zhì)量 0.5 g，加入pH值為7.5，含100 mmol/L HEPES-NaOH、8 mmol/L MgCl2、2 mmol/L EDTA、12.5%甘油(體積分?jǐn)?shù))、10 mg/L PVP-40、50 mmo1/L 2-巰基乙醇的提取液5 mL，研缽中研磨；12 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。所有操作步驟均在冰上進行。

1.3.3.2 AGPase酶和α、β-淀粉酶活性的測定 采用分光光度計法[19]測定AGPase酶和α、β-淀粉酶的活性。測定AGPase酶活性時，取20 μL粗酶液，加入110 μL pH值為 7.4，含100 mmol/L HEPES-NaOH、1.2 mmol/L ADPG、3 mmol/L PPi、5 mmol/L MgCl2、4 mmol/L DTT的反應(yīng)液，30 ℃ 反應(yīng)20 min后沸水浴30 s終止反應(yīng)，10 000 r/min離心10 min；取上清液100 μL，加入5.2 μL含5.76 mmol/L NADP、0.08 U P-gucomutase(磷酸葡萄糖變位酶)、0.07 U G6P-脫氫酶的比色液，30 ℃反應(yīng)10 min；以20 μL煮沸的酶粗液作為對照，測定波長為340 nm的吸光度。AGPase活性單位定義為U，1 U代表單位質(zhì)量(1 mg)的酶在波長340 nm處1 min反應(yīng)液的吸光度值增加0.01。

測定α、β-淀粉酶活性時，首先制作麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：麥芽糖溶液與3，5-二硝基水楊酸(DNS)沸水浴反應(yīng)5 min，冷卻，測定波長為520 nm處的吸光度，并建立以吸光度為縱坐標(biāo)、麥芽糖含量為橫坐標(biāo)的回歸方程。其次，測定總淀粉酶活性：取10 mL試管2支，分別加入各1 mL的粗酶液、檸檬酸緩沖液；分別加入4 mL 0.4 mol/L NaOH，37 ℃水浴10 min后各加入37 ℃預(yù)熱的1%可溶性淀粉2 mL，水浴5 min，在含粗酶液的試管中加入4 mL 0.4 mol/L NaOH終止酶反應(yīng)；取 10 mL 刻度試管3支，分別加入蒸餾水、粗酶液處理液、檸檬酸緩沖液處理液2 mL；每管加入3，5-二硝基水楊酸溶液 2 mL，沸水浴準(zhǔn)確煮沸5 min；取出冷卻，加入10 mL蒸餾水，搖勻，波長525 nm處測定吸光度；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出麥芽糖濃度、總淀粉酶活性。最后，測定α、β-淀粉酶活性：粗酶液70 ℃保溫15 min，再按照總淀粉酶活性的測定方法測得α-淀粉酶活性，則得β-淀粉酶活性=總淀粉酶活性-α-淀粉酶活性。1個α、β-淀粉酶活性單位定義為單位質(zhì)量(1 mg)的酶 1 min 催化底物所釋放1 nmol麥芽糖。

1.3.4 蛋白含量 按照Appenroth等的方法[20]測定。將粗酶液稀釋10倍；取稀釋的酶液1 mL，加入5 mL考馬斯亮蘭 G-250溶液，充分搖勻，靜置2 min，測定波長595 nm處的吸光度，根據(jù)以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

釆用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析；采用Origin 8.0軟件進行作圖；采用單因素方差分析或t檢驗法對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 浮萍休眠體形成過程中淀粉含量及生長速度的變化

試驗結(jié)果表明，浮萍休眠體呈暗綠色，邊緣較厚。由圖1可見，ABA處理0～1 d即浮萍休眠體形成前期，葉狀體數(shù)量由32個增加到50個，生長迅速；ABA處理1～2 d，浮萍葉狀體數(shù)目略有增加，到57個，生長速度增加趨緩；ABA處理3～7 d，浮萍的葉狀體數(shù)量減少，葉狀體繁殖受到一定抑制。由圖2可見，ABA處理0～3 d，浮萍葉狀體淀粉含量由20.9%緩慢增加到26.5%；ABA處理3～5 d，浮萍葉狀體出現(xiàn)較為快速的淀粉積累，淀粉含量由26.5%增加到36.7%；ABA處理7 d即形成休眠體時，休眠體中的淀粉含量迅速達(dá)到 65.0%。由此可見，浮萍在休眠體形成過程中，浮萍的生長受到抑制，對糖類的利用降低，從而將更多的糖儲存起來，淀粉積累是休眠體形成過程中最明顯的特征。

2.2 浮萍休眠體形成過程中葉綠素含量的變化

光合色素含量高低對浮萍光合作用強弱、淀粉積累多少具有重要的作用。由圖3、圖4可見，在浮萍休眠體形成過程中，葉狀體光合色素葉綠素a(chl a)、葉綠素b(chl b)含量呈下降趨勢，與葉綠素a含量相比，葉綠素b含量下降程度相對更大，葉綠素a、葉綠素b比值呈上升趨勢；ABA處理0～2 d即浮萍休眠體形成前期，chl a含量基本保持不變，而chl b含量明顯下降；ABA處理2～5 d，浮萍葉狀體中的chl a、chl b含量均下降較快；浮萍休眠體(ABA處理7 d)時的光合色素含量明顯低于葉狀體中的含量。

2.3 浮萍休眠體形成過程中AGpase活性的變化

AGPase是淀粉合成的關(guān)鍵酶和限速酶，能催化ATP和葡萄糖合成ADP-葡糖糖，而ADP-葡萄糖又是合成直鏈淀粉和支鏈淀粉的底物。由圖5可見，ABA處理0～2 d，浮萍AGPase活性明顯增加，AGPase活性由19.5 U快速增加到33.5 U，并達(dá)到最大值，酶活性增加71.8%；后隨ABA處理時間的延長，AGPase活性下降，ABA處理3～5 d時AGPase活性為7.5 U左右；浮萍休眠體的AGPase活性為0.047 U，明顯低于葉狀體中的活性，較未經(jīng)ABA處理的葉狀體其活性下降99.8%。

2.4 浮萍休眠體形成過程中α、β-淀粉酶活性的變化

α、β-淀粉酶是淀粉水解的關(guān)鍵酶，并能將直鏈葡聚糖水解成麥芽糖。由圖6可見，在浮萍休眠體形成過程中，α、β- 淀粉酶活性整體呈下降趨勢；與初始葉狀體即未用ABA處理相比，ABA處理5 d時葉狀體α、β-淀粉酶活性分別下降22.4%、46.0%；ABA處理0～1 d即休眠體形成前期，α-淀粉酶活性基本保持不變，而β-淀粉酶活性有明顯增加；與葉狀體相比，浮萍休眠體中的α、β-淀粉酶活性明顯低于葉狀體，α、β-淀粉酶活性均受到不同程度的抑制。

2.5 淀粉含量與AGpase、α-淀粉酶、β-淀粉酶活性的相關(guān)性分析

由表1可見，在浮萍休眠體形成過程中，淀粉含量與AGPase活性呈不顯著負(fù)相關(guān)，與α、β-淀粉酶活性呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.965、-0.888；α-淀粉酶活性和β-淀粉酶活性呈不顯著正相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

本試驗通過ABA誘導(dǎo)紫萍葉狀體形成休眠體，研究此過程中葉狀體、休眠體中淀粉、葉綠素含量及ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、α-淀粉酶、β-淀粉酶的活性變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在浮萍形成休眠體過程中，葉狀體的生長繁殖受到一定的抑制，其淀粉含量有所增加，這可能是由于浮萍葉狀體生長速率的降低導(dǎo)致對糖類的利用降低，從而將更多的糖儲存起來，進而導(dǎo)致淀粉的積累，AGPase活性在ABA處理2 d時有大幅度的增加，增幅達(dá)71.8%，但在休眠體時明顯下降，較未經(jīng)ABA處理的葉狀體其活性下降99.8%，與Wang等的研究結(jié)論[5]相吻合；淀粉酶α、β-淀粉酶的活性整體呈下降趨勢。通過相關(guān)性分析結(jié)果表明，在浮萍休眠體形成過程中，淀粉含量與淀粉酶活性高度相關(guān)，淀粉含量與α、β-淀粉酶的相關(guān)系數(shù)分別高達(dá)-0.965、-0.888，達(dá)到極顯著負(fù)相關(guān)水平(P<0.01)，淀粉含量與AGPase活性的相關(guān)性未達(dá)到顯著水平。因此，浮萍休眠體主要通過抑制淀粉的降解來積累淀粉。

表1 浮萍休眠體形成過程中淀粉含量與AGpase、α-淀粉酶、

注：*、**分別代表兩因素之間顯著(P<0.05)、極顯著相關(guān)(P<0.01)。

休眠體是浮萍生命周期中的一個重要階段，是浮萍儲存淀粉、抵御外界惡劣環(huán)境的一個重要器官，顯微鏡下可觀察到其帶有細(xì)微的根。浮萍休眠體相當(dāng)于陸生植物的種子，不同之處在于浮萍休眠體的形成是無性繁殖，而植物種子的形成主要通過有性繁殖。浮萍休眠體的形成主要受2個因素的影響：一種是激素，另一種是營養(yǎng)元素尤其是磷元素的缺乏。浮萍在經(jīng)過冬眠之后，在合適的溫度和光照條件下，細(xì)胞內(nèi)的碳水化合物會發(fā)生變化，并從2個分生側(cè)囊中生長出新的葉狀體。ABA是一種重要的植物激素，在植物逆境脅迫和調(diào)節(jié)植物種子休眠中發(fā)揮著重要的作用，能夠使植物更好地適應(yīng)惡劣環(huán)境，同時，ABA在植物體內(nèi)對糖類、淀粉的合成和運輸也發(fā)揮著重要的作用。有研究表明，少根紫萍在磷缺乏形成休眠體過程中，其淀粉含量可以達(dá)到75%[21]，相當(dāng)于谷類玉米、高粱、小麥種子的淀粉量[22]；大米懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞中，ABA能上調(diào)AGPase基因的表達(dá)，而在種子萌發(fā)過程中，ABA會抑制GA誘導(dǎo)的α-淀粉酶基因表達(dá)和β-淀粉酶活性[15]；低濃度(1 μmol/L)ABA能夠提高淀粉的合成，而高濃度(100 μmol/L)ABA反而會降低淀粉含量[23]。ABA對淀粉的合成發(fā)揮著重要的作用，有關(guān)浮萍葉狀體或休眠體中的淀粉與ABA含量的相關(guān)性還有待進一步研究。