，，

(浙江省縉云縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，浙江 縉云 321400)

豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白中的E2蛋白是囊膜糖蛋白，也是豬瘟病毒的主要保護(hù)性抗原，研究表明E2蛋白是豬瘟病毒的一個(gè)重要免疫蛋白，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體從而提供保護(hù)性免疫，用E2蛋白免疫豬只，能有效抵御豬瘟強(qiáng)毒的攻擊。因此它已成為當(dāng)今豬瘟免疫和檢測(cè)研究的熱點(diǎn)，以E2蛋白抗體為檢測(cè)對(duì)象的阻斷ELISA在豬瘟抗體的監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)中得到了充分的運(yùn)用。但是目前的豬瘟防疫尚以弱毒疫苗為主，其免疫血清都為多克隆抗體，而實(shí)驗(yàn)中多采用豬瘟正向間接血凝試驗(yàn)，正是利用多克隆抗體能與抗原結(jié)合產(chǎn)生凝集、沉淀的原理來(lái)檢測(cè)抗體效價(jià)。同時(shí)豬瘟免疫最易受到藍(lán)耳病毒PRRSV的免疫抑制干擾，產(chǎn)生免疫耐受，從而影響了除E2外其它多種抗體的產(chǎn)生，用正向間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)顯示：PRRSV感染豬的豬瘟免疫，不但不能提升免疫抗體水平，甚至可下降至2 log直至1.5 log；但用豬瘟E2蛋白阻斷ELISA試驗(yàn)顯示：其受檢血清的抗體阻斷率則不受豬PRRSV免疫抑制干擾的影響，且與豬瘟間接血球凝集試驗(yàn)的合格與否和效價(jià)高低無(wú)關(guān)，與豬瘟IHA試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果高度相關(guān)。即當(dāng)PRRSV感染豬的豬瘟免疫的IHA效價(jià)下降為零合格率時(shí)，E2阻斷ELISA的合格率仍可高達(dá)90%，雖然兩種試驗(yàn)結(jié)果反差之大，可IHA試驗(yàn)的陽(yáng)性結(jié)果則與E2蛋白阻斷ELISA的陽(yáng)性結(jié)果有90%以上的符合率，即當(dāng)IHA試驗(yàn)為合格時(shí)同樣高度符合E2阻斷ELISA的試驗(yàn)結(jié)果，從而可推斷出E2蛋白的抗免疫抑制能力。了解這些現(xiàn)象的本質(zhì)，對(duì)做好豬瘟免疫及檢測(cè)工作，可能會(huì)有較重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30日齡PRRSV隱性感染豬，來(lái)自縉云縣某豬場(chǎng)，長(zhǎng)勢(shì)一般，無(wú)可見(jiàn)臨床癥狀。

1.2 疫苗與試劑 豬瘟疫苗由中牧股份生產(chǎn)，批號(hào)：1712017-2；高致病性豬藍(lán)耳滅活苗由杭州/佑本生產(chǎn)，批號(hào)：170605；豬瘟間接血凝抗體檢測(cè)試劑盒由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，批號(hào)：20171019202；IDEXX豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒來(lái)自于北京愛(ài)德士元亨生物科技有限公司REF99-43220 31-OCT-2018；LSI豬繁殖和呼吸綜合征抗體檢測(cè)試劑盒來(lái)自于北京天之泰生物科技有限公司 批號(hào)MAY-2018。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 設(shè)試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組(均為PRRSV感染組)和對(duì)照組(PRRSV防疫組)，每組10頭。各組仔豬于30日齡時(shí)各肌注豬瘟疫苗2 mL/頭；對(duì)照組則同時(shí)分點(diǎn)肌注豬藍(lán)耳滅活苗2 mL/頭，注：豬瘟與藍(lán)耳分點(diǎn)注射。首免后2周，以上法同樣劑量加強(qiáng)免疫1次，分別于30 d、37 d、44 d、57 d、72 d、89 d、100 d、130 d、180 d時(shí)靜脈采血分離血清，用間接血凝法和阻斷ELISA法檢測(cè)豬瘟抗體效價(jià)，以間接ELISA法檢測(cè)豬藍(lán)耳抗體，再以間接血凝試驗(yàn)陽(yáng)性阻斷ELISA陰性者，用豬瘟疫苗再行加強(qiáng)免疫，3周后采血檢驗(yàn)，如陰性結(jié)果則再免疫再檢驗(yàn)。

1.3.2 試驗(yàn)血清的檢驗(yàn)

1.3.2.1 豬瘟正向間接血凝試驗(yàn) 操作方法依據(jù)國(guó)家《豬瘟診斷技術(shù)》(GB/T16551-208)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。試驗(yàn)成立條件：對(duì)照孔無(wú)自凝現(xiàn)象，陽(yáng)性對(duì)照血清抗體效價(jià)≥1∶256、陰性對(duì)照 ≤1∶8。為排除非特異性凝集，待檢血清使用前經(jīng)56℃水浴滅活30 min。結(jié)果判定：以呈現(xiàn)“++”血凝反應(yīng)的最高稀釋度為該血清的間接血凝抗體效價(jià)。

1.3.2.2 豬瘟阻斷ELISA試驗(yàn) 操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)。實(shí)驗(yàn)有效性：陰性對(duì)照平均OD(450)>0.5，陽(yáng)性對(duì)照平均阻斷率%≥50。計(jì)算公式：

阻斷率%=100[NCXA(450)-樣品A(450)]/NCXA(450)

結(jié)果判定：

陰性可疑陽(yáng)性阻斷率%≤3030<阻斷率%<40阻斷率%≥40

1.3.2.3 豬繁殖和呼吸綜合征抗體間接ELISA檢測(cè)試驗(yàn) 操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)，實(shí)驗(yàn)成立條件：陽(yáng)性對(duì)照的平均值OD450>0.6，而且陽(yáng)性對(duì)照平均值/陰性對(duì)照平均值>4.0 IRPC計(jì)算公式：

IRPC=[(OD450樣品-OD450陰性對(duì)照平均值)/(OD450陽(yáng)性對(duì)照平均值-OD450陰性對(duì)照平均值)]×100

IRPCPRRS抗體說(shuō)明

小于或者等于20陰性大于20.0陽(yáng)性

2 結(jié) 果

2.1 豬瘟正向間接血凝試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)組豬瘟的免疫，因受PRRSV的免疫抑制干擾的影響，在180日的觀察期內(nèi)，豬瘟平均抗體效價(jià)下降至3 log 及3至1.5 log。而對(duì)照組(即PRRSV被控制組)的豬瘟免疫，其豬瘟平均抗體效價(jià)即能從4 log上升至9.5 log，并能長(zhǎng)期維持在8.4 log左右。見(jiàn)表1。

表1 PRRSV對(duì)豬瘟疫苗的免疫抑制危害

表中效價(jià)為各試驗(yàn)組中的10個(gè)樣本平均數(shù)。

PRRSV對(duì)豬瘟疫苗的免疫抑制結(jié)果如圖1。

注：豬瘟間接血凝試驗(yàn)的血凝效價(jià)是取以2為底的對(duì)數(shù)。圖1 PRRSV對(duì)豬瘟疫苗的免疫抑制曲線

2.2 豬瘟阻斷ELISA試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)期間試驗(yàn)組的平均合格率為93%，且在180日齡時(shí)仍能維持在100%。而對(duì)照組(即PRRSV被控制組)試驗(yàn)期間平均合格率也僅有90%。兩者無(wú)明顯區(qū)別(見(jiàn)表2)。

豬瘟正向間接血凝試驗(yàn)和阻斷ELISA試驗(yàn)反應(yīng)，當(dāng)PRRSV感染豬(試驗(yàn)組)受到免疫抑制下調(diào)抗體水平表現(xiàn)零免疫合格率時(shí)，豬瘟E2蛋白卻仍有高達(dá)90%以上的免疫合格率，而且兩試驗(yàn)組間無(wú)明顯差異，從而可證：它有堅(jiān)強(qiáng)的抗免疫抑制能力。

2.3 間接血凝試驗(yàn)與阻斷ELISA的結(jié)果符合率 試驗(yàn)證實(shí)間接血凝試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果與阻斷ELISA結(jié)果高度相關(guān)，其符合率在90%以上，但它們的效價(jià)大小卻與阻斷率無(wú)關(guān)(見(jiàn)表3、表4 )。

雖然當(dāng)PRRSV感染豬(試驗(yàn)組)受到免疫抑制下調(diào)抗體水平表現(xiàn)零免疫合格率時(shí)，豬瘟E2蛋白抗體陽(yáng)性率卻為90%，差異極顯著。但對(duì)照組的兩試驗(yàn)結(jié)果符合率卻高達(dá)90%。

表2 豬瘟E2蛋白抗體阻斷ELISA試驗(yàn)

表3 豬瘟間接血凝試驗(yàn)與阻斷ELISA試驗(yàn)結(jié)果符合率

表4 豬瘟間接血凝效價(jià)高低與E2蛋白抗體阻斷率的相關(guān)性

注：表4序號(hào)1～10為試驗(yàn)組；11～20為對(duì)照組100日齡仔豬試驗(yàn)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：豬瘟的間接血凝效價(jià)高低與E2蛋白抗體阻斷率的大小與否無(wú)關(guān)。

2.4 各試驗(yàn)組的藍(lán)耳抗體檢測(cè)結(jié)果 豬藍(lán)耳抗體檢測(cè)顯示：試驗(yàn)組豬群PRRSV感染嚴(yán)重，見(jiàn)表5。

表5 PRRSV感染豬與抗感染豬的

以上不難發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組與對(duì)照組的藍(lán)耳抗體陽(yáng)性率則沒(méi)有明顯區(qū)別，如僅以抗體陽(yáng)性率來(lái)評(píng)估豬藍(lán)耳疫苗的免疫質(zhì)量，是容易出現(xiàn)較大誤差的。

2.5 豬瘟E2蛋白的遺傳特性 經(jīng)二次豬瘟疫苗免疫后，ELISA結(jié)果不合格者，再多次重免后抽測(cè)結(jié)果其阻斷率仍不合格，記錄見(jiàn)表6。

表6 豬瘟E2蛋白免疫耐受試驗(yàn)

3 結(jié)果與討論

3.1 試驗(yàn)顯示 豬瘟免疫抗體效價(jià)，是免疫血清(多克隆抗體)在正向間接血凝試驗(yàn)中的直接反應(yīng)，機(jī)體因受PRRSV免疫抑制的干擾，其豬瘟免疫抗體效價(jià)會(huì)下調(diào)至2 log以下?？刂芇RRSV的感染，能上調(diào)間接血凝效價(jià)的合格率為100%。認(rèn)識(shí)其作用機(jī)制對(duì)進(jìn)一步做好豬瘟和PRRSV的防疫和凈化工作有著重要的指導(dǎo)意義。

3.2 試驗(yàn)表明 當(dāng)試驗(yàn)組(PRRSV感染組)豬瘟間接血凝試驗(yàn)的群體合格率下降為零時(shí)，豬瘟E2蛋白抗體群體合格率(阻斷率)卻依然在90%以上，且與對(duì)照組(PRRSV控制組)ELISA試驗(yàn)的合格率基本一致。由此提示：PRRSV對(duì)豬瘟E2蛋白的免疫干擾影響甚微，亦則證明了豬瘟E2蛋白有可靠的抗免疫抑制能力。因此，它可以解釋豬藍(lán)耳病毒能對(duì)豬瘟免疫產(chǎn)生抑制干擾，影響了多克隆抗體的血凝效價(jià)，但阻礙不了E2蛋白抗體的產(chǎn)生。

3.3 試驗(yàn)提示 豬瘟間接血凝效價(jià)的高低與E2蛋白抗體阻斷率的大小無(wú)關(guān)，但它的陽(yáng)性結(jié)果則與E2蛋白ELISA試驗(yàn)的合格率高度相關(guān)。由于豬瘟E2蛋白抗體具有堅(jiān)強(qiáng)的抗病毒能力，因此在有PRRSV感染的環(huán)境條件下，僅以間接試驗(yàn)的零合格率來(lái)評(píng)估豬瘟免疫質(zhì)量肯定是欠科學(xué)的，當(dāng)IHA試驗(yàn)出現(xiàn)陰性結(jié)果時(shí)，再用豬瘟E2蛋白ELISA試驗(yàn)復(fù)核是必要的。雖然豬瘟間接血凝試驗(yàn)的陽(yáng)性結(jié)果與E2蛋白的阻斷ELISA的結(jié)果有90%以上的符合率，但仍可從試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有些個(gè)體多次免疫耐受的特質(zhì)，是否有與遺傳因素有關(guān)，有待進(jìn)一步探討。