賈曉曼,翟 浩,張 勇,馬亞男,李曉軍

(山東省果樹研究所,山東 泰安 271000)

病原物的檢測在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、食品、海關(guān)等方面的需求極多,需要操作簡便、效率高、條件簡易、結(jié)果易觀察、實地性強的檢測方法,滿足快速檢測及現(xiàn)場檢測的工作需要。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)便具有上述特點[1]。自LAMP技術(shù)產(chǎn)生以來,已經(jīng)在多種病原物的檢測上得到應(yīng)用。許多學(xué)者將LAMP與反轉(zhuǎn)錄、微流體、橫向流動試紙條等技術(shù)結(jié)合起來[2-4],展示了廣闊的發(fā)展和應(yīng)用前景。本文從LAMP的原理、染料和助劑的選擇及研究進(jìn)展方面進(jìn)行了綜述。

1 LAMP的原理及檢測

1.1 LAMP的原理

LAMP技術(shù)由Notomi等[1]于2000年首次報道。在65 ℃左右條件下,DNA處于動態(tài)平衡狀態(tài),可利用特異性引物及鏈置換DNA聚合酶,使鏈置換DNA不停地自我循環(huán)合成,終產(chǎn)物是含有若干反向重復(fù)目標(biāo)片段和花椰菜結(jié)構(gòu)的莖環(huán)DNA[1-5]。反應(yīng)體系一般包括Bst DNA聚合酶緩沖液、Bst DNA聚合酶、dNTP、4條引物、模板DNA、輔助劑、Mg2SO4和染料等。反應(yīng)中只需要Bst DNA聚合酶,即可在等溫條件下進(jìn)行基因擴增[1-5],其動態(tài)原理圖可參考網(wǎng)站http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/anim.html。LAMP具有以下優(yōu)點:擴增效率高,擴增時間短,在15～60 min內(nèi)便可使DNA量放大109～1010倍;特異性較高,產(chǎn)生大量擴增產(chǎn)物及焦磷酸鎂沉淀,可通過觀察沉淀來判斷檢測目標(biāo)基因序列的存在[6-7]。

1.1.1 引物設(shè)計 Notomi等發(fā)現(xiàn)目的DNA大小選擇在130～200 bp可獲得最好的結(jié)果,超過500 bp時擴增效果差,因此,包含F(xiàn)2和B2的目的片段應(yīng)小于300 bp[1]?？捎迷诰€軟件Primer Explore (http://primerexplorer.jp/e/)確定引物區(qū)域及引物。圖1摘自Mori[8],其中正向外引物F3與F3c區(qū)域互補,內(nèi)引物FIP由與F2c區(qū)互補的F2區(qū)和與F1c區(qū)相同的序列組成,環(huán)引物L(fēng)F與F2/F1區(qū)域互補,反向引物B3、BIP、LB同理。

6個引物:F3、FIP、LF、B3、BIP、LB。6個區(qū)域:F3c、F2c、F1c、B1、B2、B3。

LAMP引物應(yīng)符合以下要求:F2和B2的5′端之間的距離為120～180 bp；F2、F3以及B2、B3間的距離為0～20 bp。成環(huán)區(qū)域(F2的5′到F1的3′,B2的5′到B1的3′)的距離為40～60 bp。Tm值在正常或富含GC的情況下為60～65 ℃,在富含AT的情況下為55～60 ℃[1]。依據(jù)F1c/B1c的5′末端和F2/B2及F3/B3的3′末端6 bp的dG值小于-16.75 kJ/mol的標(biāo)準(zhǔn),來確定引物末端的穩(wěn)定性。除引物區(qū)域外的目的DNA若存在限制性內(nèi)切酶位點,則可用于確認(rèn)擴增產(chǎn)物的特異性[8]。

4個引物在初始步驟中與目的DNA的雜交會影響LAMP的效率,應(yīng)選擇合適的引物序列和長度,使Tm值在一定范圍內(nèi)。F2、B2的Tm值宜在60～65 ℃之間,即Bst聚合酶的最佳溫度。Flc、Blc的Tm值應(yīng)略高于F2、B2的,以便在從模板釋放單鏈DNA后立即形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。F3、B3的Tm值應(yīng)低于F2、B2的,以確保從內(nèi)部引物起始的合成早于從外部引物起始的合成。此外，外引物與內(nèi)引物的濃度比應(yīng)在1/4～1/10[9]。也有研究者設(shè)計了環(huán)引物[8,10],環(huán)引物并非必需,但能將擴增時間縮短約1/3～1/2,可在30 min之內(nèi)完成擴增[11]。

1.1.2 LAMP的反應(yīng)過程 LAMP的反應(yīng)過程如圖2所示,摘自Mori[43],分以下3個階段:

第一階段為起始材料生產(chǎn)階段。在60～65 ℃溫度條件、Bst聚合酶的作用下,引物FIP的F2序列與模板F2c區(qū)域結(jié)合向前延伸,引物F3與模板F3c結(jié)合置換出完整的FIP鏈,FIP鏈上的Flc與F1堿基配對形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。引物BIP、B3的原理與引物FIP、F3類似,與FIP鏈結(jié)合延伸,最終產(chǎn)物兩端均能形成環(huán)狀結(jié)構(gòu),該啞鈴狀產(chǎn)物即LAMP循環(huán)擴增的起始模板。啞鈴狀產(chǎn)物有兩種,分別暴露F2c和B2c端,形成沒有先后,在整個反應(yīng)體系中隨機發(fā)生。

第二階段為循環(huán)擴增階段。以啞鈴狀產(chǎn)物為模板,引物FIP、BIP分別與F2c、B2c區(qū)域結(jié)合,開始鏈置換合成,解離出的單鏈核酸也會在兩端形成啞鈴狀的結(jié)構(gòu)。同時啞鈴狀產(chǎn)物以自身為模板,以3′末端的F1、B1區(qū)域為起點,進(jìn)行DNA鏈置換及合成,形成新的莖環(huán)狀結(jié)構(gòu),產(chǎn)物長度增加1倍。引物FIP、BIP上的F2、B2區(qū)域也可與之結(jié)合,啟動新一輪的循環(huán)擴增。

第三階段為延伸再循環(huán)階段。引物FIP、BIP的F2、B2區(qū)域可以結(jié)合先前的產(chǎn)物進(jìn)行擴增,產(chǎn)物也能以自身為模板進(jìn)行合成,且產(chǎn)物長度增加1倍。由此下去,最終形成具有不同長度、不同數(shù)目莖環(huán)結(jié)構(gòu)和反向重復(fù)序列的DNA混合物,電泳后呈現(xiàn)瀑布狀梯形條帶[1,10]。

1.1.3 LAMP的結(jié)果檢測 判定LAMP結(jié)果的方法主要有以下幾種:(1)Mg2+與從dNTP中析出的焦磷酸根離子結(jié)合,形成乳白色的焦磷酸鎂沉淀,可通過觀察是否產(chǎn)生白色沉淀,或應(yīng)用實時濁度儀來監(jiān)測反應(yīng)結(jié)果[12-13],使擴增和產(chǎn)物檢測能夠一步完成;(2)加入染料觀察是否產(chǎn)生相應(yīng)的顏色變化[14];(3)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,看是否有典型的瀑布狀梯形條帶[1,10];(4)通過恒溫擴增微流控芯片實時觀察反應(yīng)結(jié)果[15]。

染色檢測法因其直觀性和簡便性而最為常用。根據(jù)染料對反應(yīng)是否產(chǎn)生抑制,染料可在反應(yīng)后或反應(yīng)前添加。但在反應(yīng)后開蓋添加,易在空氣中產(chǎn)生氣溶膠,并在之后的檢測中造成假陽性。染料和輔助劑的種類都會對反應(yīng)效率及結(jié)果判斷造成影響。因此,根據(jù)染料、輔助劑的作用特點進(jìn)行合理的選擇及應(yīng)用,對LAMP結(jié)果的正確性和可靠性有重要意義。

圖2 LAMP機制示意圖

1.2 染料的選擇

染料的種類有很多,應(yīng)用較多的有3種:鈣黃綠素[10,16]、SYBR Green[17]和羥基萘酚藍(lán)[18-20](表1)。

由于不同染料的作用原理不同,加入的時間和用量也不同,作用條件、顏色變化也有差異,觀察者以個人標(biāo)準(zhǔn)判斷顏色差異也會對LAMP結(jié)果造成影響。因此,如何合理地選擇和使用顏料,是實驗人員面臨的重要問題。

1.2.1 鈣黃綠素 鈣黃綠素(Calcein)是一種絡(luò)合指示劑和熒光指示劑。Tomita等[16]用鈣黃綠素和氯化錳開發(fā)了一種有效的LAMP終點檢測方法。將鈣黃綠素溶于二甲基亞砜(DMSO)成5 mmol/L溶液,再用蒸餾水配制成0.5 mmol/L鈣黃綠素、10 mmol/L MnCl2的儲備溶液。鈣黃綠素通過與適量的Mn2+結(jié)合而熒光淬滅,隨著反應(yīng)中產(chǎn)生的焦磷酸根離子與Mn2+生成沉淀,鈣黃綠素與Mg2+結(jié)合,又產(chǎn)生熒光[10]。應(yīng)注意在低濃度的Mg2+條件下,酶活性降低,產(chǎn)物量下降,在Mg2+濃度過高時,會出現(xiàn)非特異性反應(yīng),所以應(yīng)選擇合適的Mg2+濃度[21]。Loopamp熒光檢測試劑(LMP221)的主要成分為鈣黃綠素,并就其對紫外線的照射要求進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)：當(dāng)鈣黃綠素處于短波長(240 nm)到長波長(370 nm)時,產(chǎn)生黃綠色熒光；在中間波長(325 nm)的激發(fā)光下熒光最強；當(dāng)激發(fā)光接近320 nm時,雖然從陽性樣品觀察到的熒光增強,但陰性對照的熒光也加強。因此,建議在短波長(240～260 nm)或長波長(350～370 nm)的激發(fā)光下進(jìn)行LAMP可視熒光檢測,通過比較樣品與陽性、陰性對照的熒光強度進(jìn)行判斷。

表1 染料的種類及使用量

1.2.2 SYBR Green I SYBR Green I的靈敏度較高,能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部分,加入后會影響酶的效果,所以宜在反應(yīng)結(jié)束后加入。但在反應(yīng)后開蓋加染料,產(chǎn)物會形成氣溶膠,引起產(chǎn)物或后續(xù)LAMP反應(yīng)的污染,從而造成假陽性[17]。不少試驗人員選擇將SYBR Green I于反應(yīng)前滴加于反應(yīng)管的蓋上,反應(yīng)后通過彈入或離心將染料與反應(yīng)體系混勻,避免了對反應(yīng)效率的影響及對產(chǎn)物的污染[22]。但需注意的是,在PCR儀開啟熱蓋的模式下,染料會變干凝固,不易回溶,所以宜采用水浴或PCR儀不開熱蓋的模式。SYBR Green I不能特異性地指示擴增產(chǎn)物,在存在引物二聚體或非特異性產(chǎn)物的情況下也有熒光,易造成假陽性,對引物的設(shè)計要求較嚴(yán)格[4]。

1.2.3 羥基萘酚藍(lán) 羥基萘酚藍(lán)(hydroxy naphthol blue, HNB)可與Mg2+結(jié)合而呈紫羅蘭色；隨著LAMP反應(yīng)的進(jìn)行,從dNTP析出的焦磷酸根離子與Mg2+生成沉淀,失去Mg2+的HNB變成天藍(lán)色,而陰性對照仍為紫羅蘭色,陰性和陽性結(jié)果差異明顯[22]。HNB在終濃度為120 μmol/L時對擴增沒有抑制,可在反應(yīng)前加入[23]。反應(yīng)可在96孔微孔板中進(jìn)行,用酶標(biāo)儀測量650 nm處的吸光度,體系中的HNB暴露于環(huán)境光超過2周,顏色仍然穩(wěn)定[23]。陰性反應(yīng)的結(jié)果與甜菜堿的使用與否有關(guān),使用甜菜堿時,陰性反應(yīng)呈紫羅蘭色,否則呈天藍(lán)色[24-25]。

上述3種染料相互比較,SYBR Green I和HNB的檢測靈敏度比鈣黃綠素高10倍,可能由于Mn2+的抑制,或者鈣黃綠素與DNA的相互作用引起鈣黃綠素靈敏度的降低[23]。

1.3 輔助劑的選擇

不同的輔助劑會對LAMP的效率和結(jié)果產(chǎn)生不同的影響,應(yīng)根據(jù)輔助劑的作用特點進(jìn)行合理的選擇及應(yīng)用。在使用助變性劑提高PCR反應(yīng)的特異性和避免異常產(chǎn)物擴增中,需將輔助劑的用量控制在對酶活性沒有抑制的范圍內(nèi)[25]。在高GC含量靶序列的擴增時,模板所具有的高變性溫度會導(dǎo)致擴增效率降低,而助變性劑在降低Tm值和提高反應(yīng)特異性方面有良好的效果[26-31]。

1.3.1 甜菜堿 DNA可能含有復(fù)雜的堿基(Py-G-C),使DNA聚合酶停滯而影響延伸。甜菜堿(Betaine)可通過提高富含GC區(qū)域的水合作用,影響DNA分子結(jié)構(gòu),降低堿基堆積力,增強DNA聚合酶的穩(wěn)定性,幫助其順利沿模板延伸[32]。Spiess等[34]發(fā)現(xiàn),甜菜堿也能減少RNA二級結(jié)構(gòu),降低RNA的Tm,保持逆轉(zhuǎn)錄酶的活性。甜菜堿能降低高GC含量序列的Tm值,使引物的Tm值接近,使反應(yīng)更加容易進(jìn)行[33]。魏洪巖等[35]發(fā)現(xiàn),甜菜堿的有無對于檢測蘋果根結(jié)線蟲的LAMP擴增效果沒有明顯影響,且達(dá)到一定濃度后反而會抑制擴增反應(yīng),這主要是由擴增區(qū)域GC含量較低造成的。盧永燦[36]在擴增蘋果褪綠葉斑病毒(ACLSV)和蘋果莖痘病毒(ASPV)時,甜菜堿的濃度為0～1.6 mol/μL時條帶有逐漸變亮的趨勢,當(dāng)不加甜菜堿或所加濃度過高時,均不利于反應(yīng)的進(jìn)行。所以不同反應(yīng)體系應(yīng)對甜菜堿的濃度進(jìn)行優(yōu)化,以便達(dá)到最優(yōu)產(chǎn)物量。

1.3.2 L-脯氨酸 研究發(fā)現(xiàn),使DNA螺旋不穩(wěn)定的化學(xué)物質(zhì)能顯著提高LAMP的擴增效率。L-脯氨酸(L-Proline)跟甜菜堿一樣,能減少堿基積累[33,37-38],刺激反應(yīng)的整體速率,也能增加對目的DNA的選擇性,并顯著降低無關(guān)序列的擴增,從而提高結(jié)果的特異性[1]。

1.3.3 其他輔助劑 Fukuta等在RT-LAMP試驗中采用了DTT,因為其中的巰基可以保護(hù)酶的二硫鍵,進(jìn)而增加逆轉(zhuǎn)錄酶的穩(wěn)定性[2]。也有研究者采用吐溫20或NP40來消除核酸提取殘留的SDS(0.01%及0.10%)的抑制作用[39]。也有研究者通過添加DMSO提高了檢測的特異性和靈敏度[40]。

1.4 假陽性的預(yù)防措施

在LAMP反應(yīng)中,可通過以下幾點來避免假陽性的產(chǎn)生。

1.4.1 溶解液 不能使用含有螯合劑的緩沖液溶解鈣黃綠素,如TE緩沖液，因為與鈣黃綠素結(jié)合的Mn2+可被TE緩沖液中的乙二胺四乙酸(EDTA)螯合而產(chǎn)生熒光。此外,含有大量Ca2+和Zn2+的樣品也可能會造成假陽性的結(jié)果[41]。

1.4.2 紫外照射 反應(yīng)管不能長時間暴露于紫外燈下,否則可能由于熒光背景的增加或熒光的猝滅而導(dǎo)致誤判。當(dāng)紫外燈輸出太強時,陰性對照也像有熒光發(fā)射,此時可將紫外燈遠(yuǎn)離反應(yīng)管或改變反應(yīng)管的角度,以便觀察陰性、陽性對照間的差異。

1.4.3 氣溶膠 在反應(yīng)結(jié)束后,反應(yīng)管盡量不開蓋,因為開蓋后產(chǎn)物會在室內(nèi)形成氣溶膠,造成測試區(qū)域的污染。LAMP的靈敏度較高,染色法檢測易因氣溶膠而產(chǎn)生假陽性?？蓪⒓訕蛹伴_蓋電泳進(jìn)行分區(qū)實驗,或使用封閉劑從而避免氣溶膠污染的產(chǎn)生。劉威[42]以熔點為40～55 ℃的全精煉石蠟作封閉劑,于試驗前加入,反應(yīng)中封閉劑為液態(tài),反應(yīng)后為固態(tài),將產(chǎn)物封閉于管底,杜絕了氣溶膠污染造成的假陽性。為了防止擴增產(chǎn)物分散,使用過的反應(yīng)管不應(yīng)開蓋,宜保持完全封閉,并用可密封的乙烯基袋子進(jìn)行焚燒或雙層包裝,勿用高壓滅菌器處理。

2 LAMP技術(shù)的應(yīng)用前景

LAMP技術(shù)不僅能實現(xiàn)對DNA的檢測,還可直接用RNA作模板,從而實現(xiàn)對病毒的檢測。在判定LAMP擴增結(jié)果的方法中,沉淀法和染色檢驗法會因觀察者的個體差異、顏色不明顯而造成肉眼觀察不便及誤判,也不能滿足高通量檢測的要求；運用恒溫擴增微流控芯片及實時濁度儀則需要購置昂貴的分析儀器。因此,許多學(xué)者都在尋找一種廉價、便捷、準(zhǔn)確的判斷方法。

2.1 RT-LAMP

在檢測病毒時,因逆轉(zhuǎn)錄酶也存在鏈置換活性,可直接在LAMP體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶,即可在反轉(zhuǎn)錄的同時,完成對病毒的檢測[43]。RT-LAMP可實現(xiàn)對ACLSC、ASPV[36]、黃瓜花葉病毒[44]、番茄黃葉病毒(TYLCV)[45]等的監(jiān)測。由于LAMP所用的酶對生物樣品中抑制物質(zhì)的敏感性低,有助于節(jié)省樣品處理所需的時間和成本[8]。RNA提取可選擇簡單的方法,用400 μL 0.5 mol/L NaOH研磨100 mg組織,直至沒有大片組織。從該提取物中快速轉(zhuǎn)移10 μL至含有490 μL 100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)的新管中,充分混合,并取1.5 μL到25 μL反應(yīng)體系中,用于RT-LAMP試驗[39,46-47]。

2.2 LAMP+紙質(zhì)微流體技術(shù)

2007年Whitesides團(tuán)隊[48]首次提出的紙質(zhì)微流體技術(shù),又稱微流控紙基分析設(shè)備(Microfluidic pape-based analytical devices, μPADs),簡稱紙質(zhì)芯片[3],是近幾年微流控芯片發(fā)展的新方向。LAMP與紙質(zhì)微流體技術(shù)結(jié)合,有助于實現(xiàn)低資源環(huán)境下基因即時檢測系統(tǒng)的使用[8]。紙質(zhì)芯片以濾紙或?qū)游黾垶椴牧?通過切割或疏水材料處理制成含微通道的2D設(shè)備,或通過堆疊、折疊制成3D設(shè)備。將LAMP技術(shù)與芯片整合,通過儀器傳感定量檢測或肉眼觀察檢測,可同時檢測多個基因和樣本,完成對病原菌的高通量檢測,簡便低廉,在現(xiàn)場檢測等資源有限的條件下也可進(jìn)行[49]。

2.3 LAMP-LFD

LAMP-LFD通過LAMP技術(shù)與橫向流動試紙條技術(shù)(Lateral flow dipstick, LFD)相結(jié)合,使LAMP結(jié)果更加直觀。Sano等[50]建立的檢測微量抗原技術(shù)是LFD的基礎(chǔ),LAMP-LFD技術(shù)結(jié)合了分子生物學(xué)手段和免疫層析技術(shù)。在LAMP反應(yīng)結(jié)束后,將試紙條直接插入到緩沖液和擴增產(chǎn)物的混合溶液中5～10 min,由生物素標(biāo)記的LAMP產(chǎn)物與由異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的探針特異性雜交形成免疫復(fù)合物,由于層析作用而擴散,與試紙條上具有生物素抗性的檢測線結(jié)合而顯色,未雜交的探針和抗體形成二元復(fù)合物,繼續(xù)擴散并與質(zhì)控線結(jié)合顯色。LAMP-LFD最低可檢測5 pg的DNA[51],具有結(jié)果直觀、靈敏度高、設(shè)備簡單、成本低的優(yōu)點,可應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、真菌、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測等[4,35]。

3 總結(jié)

LAMP技術(shù)所需設(shè)備簡單,反應(yīng)速度快,反應(yīng)結(jié)果特異性高,易判定。染料法檢測雖然結(jié)果直觀,但不同的染料對操作的要求不同,需注意區(qū)分；染料法也可以結(jié)合吸光度檢測、沉淀觀察、電泳等進(jìn)行檢驗。應(yīng)根據(jù)目的DNA的GC含量等實際情況選擇輔助劑的添加濃度,以免抑制反應(yīng)的速率。LAMP與紙質(zhì)微流體、LFD等技術(shù)相結(jié)合,使其應(yīng)用更加便利和廣泛,可視化程度增加,在農(nóng)業(yè)病害檢測、食品安全檢測、海關(guān)檢驗檢疫中的應(yīng)用前景更加廣闊。