張學(xué)亞，吳詩(shī)馨，郭熙哲

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院血液科，福建 泉州 362000)

2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME2)是一種雌性激素類(lèi)藥物，為17β-雌二醇體內(nèi)生理代謝物。2-ME2能夠不依賴雌激素受體而選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞，并且對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒性[1-4]，根據(jù)2-ME2的這些藥效特點(diǎn)，該藥被普遍用于抗癌基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)方面的研究。體外實(shí)驗(yàn)研究表明，2-ME2可抑制許多不同組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[2]，動(dòng)物體內(nèi)的模型研究結(jié)果同樣表明，2-ME2可明顯抑制動(dòng)物腫瘤模型的體內(nèi)生長(zhǎng)，且可以大幅度消減腫瘤負(fù)荷。雖然2-ME2的抗腫瘤相關(guān)研究國(guó)內(nèi)外均有文獻(xiàn)報(bào)道，但關(guān)于抗腫瘤方面的機(jī)制仍不清楚。早期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，人急性T淋巴細(xì)胞白血病CEM細(xì)胞對(duì)2-ME2具有高度敏感性，表現(xiàn)為體外增殖受到明顯抑制，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象普遍可見(jiàn)[5-6]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證2-ME2是否對(duì)耐藥相關(guān)的急性T淋巴細(xì)胞白血病具有殺傷作用，本研究選擇耐6-巰基嘌呤的人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞6T-CEM作為體外研究的目標(biāo)細(xì)胞，探討2-ME2對(duì)6T-CEM細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為的影響及初步機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人來(lái)源的急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞6T-CEM，購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2試劑 RPMI 1640培養(yǎng)液、小牛血清(美國(guó)Gibco公司)；2-ME2、二甲基亞砜(DMSO)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，DMSO配制2-ME2的初始濃度為2 mmol·L-1，保存于4℃冰箱，臨用時(shí)培養(yǎng)液稀釋至所需濃度，藥物中DMSO終濃度小于0.1%；MTT，美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品；Akt、p-Akt(Ser473)、Bcl-2、Bax、procaspase-3兔多抗，均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；內(nèi)參蛋白β-actin鼠單抗，購(gòu)自湖北武漢博士德科技公司；蛋白酶抑制劑，購(gòu)自上海康成生物工程公司；化學(xué)發(fā)光底物相關(guān)試劑、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，均購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。

1.1.3儀器 FAX2100型酶標(biāo)儀(美國(guó)STAT公司)；DU640型紫外分光光度儀(美國(guó)貝克曼公司)；水平電泳槽(北京東方儀器廠)；垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀器(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.16T-CEM細(xì)胞的培養(yǎng) 凍存于液氮罐的6T-CEM細(xì)胞復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含有10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中。6T-CEM細(xì)胞在5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)，每3 d傳代1次。實(shí)驗(yàn)中所采用的6T-CEM細(xì)胞均處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2.2MTT法觀察6T-CEM細(xì)胞生長(zhǎng)變化 6T-CEM細(xì)胞按1×108·L-1的密度接種至96孔板，每孔200 μL。2-ME2(0.5、1、2、4、8 μmol·L-1)分別處理6T-CEM細(xì)胞，培養(yǎng)24、48 h，每個(gè)濃度組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h，向各孔中加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，離心后吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩結(jié)晶物充分溶解。492 nm和630 nm波長(zhǎng)下，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔光吸收值。按文獻(xiàn)[5]計(jì)算抑制率，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率/%=(1-實(shí)驗(yàn)組平均吸光度值/對(duì)照組平均吸光度值)×100%。

1.2.3DNA梯度片段法檢測(cè)6T-CEM細(xì)胞凋亡 2-ME2(0、1、2、4 μmol·L-1)處理6T-CEM細(xì)胞24 h，離心棄上清液，收集1×106數(shù)量級(jí)細(xì)胞，加入含蛋白酶K的樣品裂解液，振蕩混勻，充分裂解細(xì)胞。50℃水浴箱放置12 h，加入500 μL Tris平衡苯酚，振蕩混勻，吸取上清液，加入10 mmol·L-1醋酸銨和無(wú)水乙醇，顛倒混勻，沉淀DNA -20℃過(guò)夜。離心后，吸棄上清液，自然風(fēng)干DNA，立即加入蒸餾水溶解DNA，40 V電壓下，于2%瓊脂糖凝膠電泳3 h后觀察結(jié)果。

1.2.4蛋白印跡法檢測(cè)p-Akt、Akt、Bcl-2、Bax、Procaspase-3的表達(dá) 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的6T-CEM細(xì)胞，加入2 μmol·L-12-ME2，培養(yǎng)0、24、48、72 h后，離心收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，于4℃、12 000 r·min-1離心10 min， BCA法蛋白定量。取20 μg的待測(cè)蛋白，加入上樣緩沖液，99℃蛋白變性5 min，10%～15%的SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。膜放入5%的脫脂牛奶封閉2 h，分別加入待測(cè)蛋白一抗，4℃孵育過(guò)夜。加入二抗，室溫孵育2 h，用TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，利用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行檢測(cè)和分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)。組間比較采用F檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.12-ME2對(duì)6T-CEM細(xì)胞增殖的影響設(shè)置2-ME2(0.5、1、2、4、8 μmol·L-1)藥物處理組和只加培養(yǎng)液處理的對(duì)照組，觀察24、48 h兩個(gè)處理時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖情況。Fig 1的MTT結(jié)果顯示，0.5 μmol·L-12-ME2作用6T-CEM細(xì)胞24 h后，6T-CEM細(xì)胞生長(zhǎng)受抑，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率也逐漸增強(qiáng)，藥物濃度為8 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)到80%。不同濃度2-ME2作用6T-CEM細(xì)胞48 h后，細(xì)胞增殖明顯受抑制，細(xì)胞增殖抑制率隨著藥物濃度增高而逐步增加，2 μmol·L-12-ME2使6T-CEM細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到50%。提示2-ME2抑制6T-CEM細(xì)胞增殖存在著一定的量效、時(shí)效關(guān)聯(lián)性。

2.22-ME2對(duì)6T-CEM細(xì)胞凋亡的影響2-ME2(1、2、4 μmol·L-1)作用于6T-CEM細(xì)胞24 h，DNA Ladder法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。Fig 2電泳結(jié)果顯示，1 μmol·L-1的2-ME2處理細(xì)胞后，可見(jiàn)到典型的梯狀片段，隨著2-ME2濃度的增加，仍顯示出典型的梯狀片段改變，結(jié)果表明2-ME2能夠誘導(dǎo)6T-CEM細(xì)胞凋亡的發(fā)生。添加培養(yǎng)液處理的對(duì)照組細(xì)胞未見(jiàn)DNA片段化現(xiàn)象，表現(xiàn)一完整的DNA基因組，表明對(duì)照組6T-CEM細(xì)胞無(wú)凋亡改變。

Fig 1 Effects of 2-ME2 on proliferation of6T-CEM cells in 24 h and 48

Fig 2 Effect of 2-ME2 on apoptosis of6T-CEM cells in 24 h by DNA ladder

2.32-ME2對(duì)6T-CEM細(xì)胞內(nèi)各蛋白表達(dá)的影響2 μmol·L-1的2-ME2作用6T-CEM細(xì)胞0、24、48、72 h后，蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)。如Fig 3所示，作用24 h后，與對(duì)照組比較，p-Akt蛋白表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，隨著藥物處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)水平逐步下降(P<0.05)，而Akt蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，提示2-ME2抑制6T-CEM細(xì)胞增殖的過(guò)程涉及了Akt蛋白活化受抑制。如Fig 4所示，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)隨著藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)，逐漸下調(diào)；促凋亡蛋白Bax表達(dá)則逐漸上調(diào)；隨著2-ME2作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Procaspase-3表達(dá)水平逐漸下降，考慮存在促凋亡蛋白物質(zhì)的活化。提示2-ME2誘導(dǎo)6T-CEM細(xì)胞凋亡過(guò)程中存在著線粒體凋亡途徑的激活。

Fig 3 Effect of 2-ME2(2 μmol·L-1) on expressionof Akt and p-Akt in 6T-CEM

*P<0.05vscontrol

3 討論

2-ME2作為一種人體內(nèi)雌二醇的內(nèi)源性的生理代謝產(chǎn)物，有著廣泛抗腫瘤效應(yīng)，并且臨床相關(guān)的毒副作用非常少，其抗腫瘤活性得到了國(guó)內(nèi)外研究人員的關(guān)注。前期大量研究證實(shí)，2-ME2對(duì)多種非血液淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤具有抗腫瘤效果，在血液系統(tǒng)腫瘤方面也顯示出良好的抗腫瘤功效[3-7]。急性T淋巴細(xì)胞白血病是起源于造血干祖細(xì)胞惡性血液病，采取多藥化療的治療，大多數(shù)病患可達(dá)到形態(tài)學(xué)緩解，但大部分病例仍存在復(fù)發(fā)，且大多數(shù)病人容易出現(xiàn)耐藥，嚴(yán)重影響這類(lèi)白血病患者的長(zhǎng)期生存率，仍需要尋求新的藥物提高總的治療療效[8]。在前期研究2-ME2抗急性T淋巴細(xì)胞白血病CEM細(xì)胞的基礎(chǔ)上[5-6]，我們選取CEM耐6-巰基嘌呤細(xì)胞系6T-CEM作為研究對(duì)象，探討2-ME2對(duì)耐藥白血病細(xì)胞的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，2-ME2不同濃度處理可抑制6T-CEM細(xì)胞增殖。2-ME2(1、2、4 μmol·L-1)處理6T-CEM細(xì)胞，經(jīng)過(guò)DNA Ladder方法檢測(cè)到藥物處理組細(xì)胞DNA密度梯度片段化，提示細(xì)胞凋亡的發(fā)生，說(shuō)明2-ME2可通過(guò)誘導(dǎo)6T-CEM細(xì)胞凋亡，達(dá)到抑制其增殖的作用。

Fig 4 Effect of 2-ME2(2 μmol·L-1) on expressionof Bax, Bcl-2 and procaspase-3 in 6T-CEM n=3)

*P<0.05vscontrol

有研究報(bào)道[9]，2-ME2誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，涉及Bax/Bcl-2比率的改變。我們前期研究發(fā)現(xiàn)[10]，2-ME2誘導(dǎo)人慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，存在Bcl-2下降，Bax表達(dá)升高，Bax/Bcl-2比率改變。Bcl-2和Bax均屬于Bcl-2家族成員[11]，通過(guò)控制線粒體膜表面上的通透性來(lái)改變細(xì)胞的歸屬，如激活細(xì)胞色素C釋放至細(xì)胞質(zhì)中，通過(guò)一系列的生理反應(yīng)，激活caspase-3，啟動(dòng)線粒體凋亡途徑，引起細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果證實(shí)，2-ME2作用各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，可抑制Bcl-2、procaspase-3表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)。這些結(jié)果證實(shí)了2-ME2能影響6T-CEM細(xì)胞的增殖和凋亡。

細(xì)胞內(nèi)存在多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這些通路都與細(xì)胞的生存、增殖、凋亡等生物學(xué)行為密切相關(guān)。PI3K/Akt信號(hào)可通過(guò)影響其下游的多種蛋白效應(yīng)分子的激活和失活，在維持細(xì)胞生命過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的監(jiān)管作用[12-13]。研究證實(shí)，該信號(hào)通路的異常激活與腫瘤有很大的關(guān)聯(lián)性[13-14]。該通路在人急性T淋巴細(xì)胞白血病中也存在持續(xù)活化狀態(tài)，并參與白血病的發(fā)展以及耐藥、復(fù)發(fā)等病理生理過(guò)程。表明該通路上的蛋白效應(yīng)分子可能是抗白血病治療的靶點(diǎn)之一[15]。前期研究證明，2-ME2可抑制p-Akt表達(dá)而影響細(xì)胞的生存能力，總Akt表達(dá)無(wú)改變[11]。表明2-ME2影響K562細(xì)胞行為可能與抑制Akt蛋白的活化，進(jìn)而干擾PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)。本研究中，蛋白印跡法觀察到6T-CEM經(jīng)2-ME2處理24 h后，p-Akt表達(dá)減少，其表達(dá)與藥物處理時(shí)間具有相關(guān)性，而總Akt蛋白表達(dá)無(wú)改變。提示2-ME2處理6T-CEM細(xì)胞后，6T-CEM細(xì)胞表現(xiàn)出增殖受抑、發(fā)生凋亡，與其干預(yù)PI3K/Akt通路有關(guān)。因此，今后的研究工作將繼續(xù)深入探討2-ME2干擾該信號(hào)通路的具體機(jī)制。

6T-CEM屬于6-巰基嘌呤耐藥細(xì)胞，多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein, MRP)和P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)等異常表達(dá)在白血病耐藥過(guò)程中起重要作用。2-ME2抑制6T-CEM細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡的過(guò)程中，是否涉及到對(duì)MRP、P-gp等耐藥蛋白的作用，有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2-ME2可明顯抑制6T-CEM細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其抗白血病作用的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax表達(dá)，改變了兩者之間的比率，進(jìn)而激活caspase-3，啟動(dòng)內(nèi)源性凋亡途徑有關(guān)。同時(shí)，降低p-Akt蛋白表達(dá)，干擾PI3K/Akt途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)也參與了2-ME2影響6T-CEM細(xì)胞生物學(xué)行為的過(guò)程。