朱玲玲，林濤發(fā)，謝麗平，王少揚

(1.皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院感染科，安徽 蕪湖 241001；2. 廈門大學附屬東方醫(yī)院感染科，福建 福州 350001；3. 福州總醫(yī)院傳染病教研室，福建 福州 350001)

我國肝癌發(fā)病率居全球首位，每年超38萬人死于肝癌，約占全球肝癌死亡人數一半[1]。肝癌起病隱匿，發(fā)現(xiàn)時多為中晚期，且惡性程度高、侵襲性強，易復發(fā)和轉移，因此，開發(fā)出有效的治療藥物具有重要意義。逆轉素(reversine)是一種人工合成的小分子嘌呤類似物，在包括人前列腺癌、宮頸癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤中均表現(xiàn)出較強的抑制腫瘤細胞生長的作用[2-4]。Reversine的抗癌作用可能與其抑制Aurora激酶的活性有關。D′Alise等[5]發(fā)現(xiàn)，reversine可抑制白血病細胞的克隆形成，且對正常細胞的毒性作用較另一種已處于II期臨床試驗階段的Aurora激酶抑制劑VX-680更小。此外，Hua等[6]在裸鼠成瘤模型上也證實reversine可抑制腫瘤的生長。目前，reversine在肝細胞癌中的影響作用研究較少，本文就reversine對人肝癌HepG2細胞增殖、克隆形成及凋亡的影響進行探究。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器Reversine購于美國MedChemexpress生物科技公司，用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，儲存濃度為10 mmol·L-1，置于-20℃冰箱保存。胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶購于美國Gibco公司；MTS細胞增殖試劑盒購于美國Promega公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物科技公司；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、BCA蛋白檢測試劑盒、ECL化學發(fā)光試劑盒，均購自于美國Millipore公司；兔抗活化多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerases, PARP](D64E10)、Bax(E63)、Bcl-2(E17)、Bcl-xl(E18)抗體，購自美國Cell Signaling Technology公司；細胞裂解液、鼠抗人β-actin(AC-74)、β-tubulin(b-5-1-2)及辣根過氧化物酶標記的二抗，均購自碧云天公司。酶標儀(美國Thermo Fisher公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；冷凍離心機(美國Sigma公司)；凝膠掃描分析系統(tǒng)(印度Syngene公司)。

1.2細胞與培養(yǎng)人肝癌細胞株HepG2購于美國標準培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。用0.25%的胰酶消化。

1.3細胞增殖能力檢測采用MTS實驗檢測reversine對HepG2細胞增殖的影響。取對數生長期的肝癌細胞制成細胞懸液，按1×104個/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100 μL DMEM高糖培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中。待細胞貼壁后，每孔加入含不同濃度reversine(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μmol·L-1)的DMEM高糖培養(yǎng)基100 μL，對照組加入含0.01% DMSO的DMEM高糖培養(yǎng)基100 μL，每組設置6個復孔。分別于培養(yǎng)24、48、72、96 h后，棄原培養(yǎng)基，每孔加入含MTS標記試劑的DMEM高糖培養(yǎng)基(培養(yǎng)基 ∶MTS標記試劑=5 ∶1)培養(yǎng)2 h。用酶標儀檢測并記錄在490 nm及690 nm處的吸光度值。使用公式計數出抑制率：抑制率/%=(1-實驗組細胞數/對照組細胞數)×100%，并計算出IC50。

1.4細胞克隆形成能力檢測為評估reversine對肝癌細胞HepG2的遠期效應，采用克隆形成實驗來檢測其作用。將HepG2細胞消化重懸后計數，于6孔板中每孔接種1 000個細胞。待細胞貼壁后，將各孔更換為含有不同濃度reversine(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μmol·L-1)的培養(yǎng)基，陰性對照組加入等量DMSO，各組設3個復孔。將細胞放入培養(yǎng)箱孵育2周后，棄上清，用結晶紫染色30 min，PBS沖洗3次，統(tǒng)計克隆形成數目，并比較各組克隆形成的差異。

1.5流式細胞儀檢測細胞凋亡HepG2細胞經不同濃度reversine(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μmol·L-1)孵育48 h，DMSO作為陰性對照。收集細胞沉淀，用500 μL的結合緩沖液重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混勻，在室溫避光條件下孵育15 min，然后采用流式細胞儀進行細胞凋亡率檢測。

1.6Westernblot法分析蛋白表達HepG2細胞經不同分組處理后，收集細胞沉淀，用4℃預冷的PBS洗滌3遍，吸棄上清，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細胞裂解液充分混勻，置于冰上裂解30 min。隨后于4℃、12 000×g離心10 min，取上清，采用BCA蛋白檢測試劑盒進行蛋白濃度測定，并制備成蛋白樣品。SDS-PAGE凝膠電泳，電轉至PVDF膜。用5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃搖床孵育過夜，次日用TBST洗滌3遍。加入TBST稀釋的二抗，室溫搖床孵育1 h。TBST洗滌3遍，ECL化學發(fā)光試劑于凝膠掃描分析儀中檢測并分析結果。

2 結果

2.1Reversine抑制HepG2細胞的增殖HepG2細胞經不同濃度reversine(0.1～1.6 μmol·L-1)處理后，各組細胞在倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，隨reversine濃度增加，細胞密度及細胞狀態(tài)逐漸下降，圓形懸浮細胞增加，且細胞核有變大趨勢(Fig 1A)。MTS檢測結果顯示，reversine濃度越高，對HepG2細胞增殖的抑制作用越明顯，并且呈劑量和時間依賴關系(Fig 1B)。根據MTS實驗數據，HepG2的IC50值為0.94 μmol·L-1。

2.2Reversine抑制HepG2細胞的克隆形成能力Fig 2的克隆形成實驗結果顯示，HepG2細胞經不同濃度reversine(0.1～1.6 μmol·L-1)處理后，細胞的克隆形成能力明顯下降(P<0.05)，且較高濃度reversine處理組(0.2～1.6 μmol·L-1)的HepG2細胞幾乎不能形成肉眼可見的細胞克隆。

Fig 1 Effect of reversine on cell viability of HepG2 cells n=3)

2.3Reversine誘導HepG2細胞凋亡HepG2細胞經不同濃度reversine(0.1～1.6 μmol·L-1)處理后，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。如Fig 3所示，與對照組(DMSO)相比，HepG2細胞的早期凋亡率、晚期凋亡率及總凋亡率均隨reversine濃度增加而增加，呈劑量依賴關系。

2.4Reversine對凋亡相關蛋白表達的影響Fig 4結果顯示，隨reversine濃度的增加，活化的PARP水平明顯增加，說明reversine可以誘導HepG2細胞發(fā)生凋亡。同時，促凋亡蛋白Bax的表達增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2及Bcl-xL蛋白表達下降，提示reversine誘導HepG2細胞凋亡可能是通過線粒體凋亡途徑。

3 討論

肝癌嚴重危害人類健康，目前以手術為主的治療方案療效仍不甚理想。人工合成的小分子嘌呤類似物reversine被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤作用，研究證實reversine可抑制前列腺癌、宮頸癌、白血病、人口腔鱗狀細胞癌、甲狀腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌、人尿路上皮細胞腫瘤等腫瘤細胞生長。通過對文獻回顧所知，目前reversine對肝癌的研究還未見系統(tǒng)報導。原發(fā)性肝癌中肝細胞癌占85%～90%，在本研究中，我們探討了reversine對人肝癌細胞HepG2生長的影響作用。我們通過細胞增殖實驗(MTS)、細胞克隆形成實驗及細胞凋亡實驗，論證了reversine對肝癌細胞HepG2的抑制作用。結果顯示，reversine可以明顯抑制肝癌細胞HepG2的細胞增殖和克隆形成，并誘導HepG2細胞的凋亡，且與reversine的劑量呈正相關。

Fig 2 The colony formation ratio of HepG2 after treatment with different concentrations of reversine n=3)

PARP具有蛋白修飾和DNA修復功能，在細胞凋亡中起到重要作用[7]。在凋亡過程中，PARP可被活化的caspase-3裂解為兩個分子量較小的片段，即可導致?lián)p傷DNA無法及時修復，促使細胞凋亡，又為細胞凋亡儲備了更多能量。真核細胞核內PARP含量豐富，在凋亡早期就可檢測到PARP裂解片段，可作為檢測凋亡的指標之一[8]。本研究Western blot檢測結果發(fā)現(xiàn)，活化的PARP水平增加，從蛋白水平也證實了reversine可以誘導HepG2細胞的凋亡。

Fig 3 Apoptotic rate of HepG2 cells under different concentrations of reversine n=3)A: HepG2 cells were treated with DMSO or reversine, and the appototic cells were assessed by flow cytometry; B: The rates of appotosis in HepG2 cells treated with or without reversine. **P<0.01 vs DMSO group.

Fig 4 Expression of Bcl-2, Bcl-xL, Bax and cleaved-PARP in HepG2 cells after treatment with different concentrations of reversine n=3)

*P<0.05,**P<0.01vsDMSO group

線粒體是機體發(fā)生凋亡的重要場所，Bcl-2蛋白家族中的促凋亡蛋白Bax和Bak是主要的調控蛋白，可致線粒體外膜透性化，緊接著向胞質內釋放細胞色素C和凋亡蛋白酶激活因子，形成凋亡復合體，進一步活化caspase-9、caspase-3和caspase-7，最終細胞降解死亡[9]。Bcl-2蛋白家族的另外兩大成分抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL可與促凋亡蛋白Bax和Bak相互作用，參與線粒體凋亡途徑[10]。本研究Western blot檢測結果顯示，Bax的表達增加，抗凋亡蛋白Bcl-2及Bcl-xL表達下降，提示reversine誘導HepG2細胞凋亡可能是通過線粒體凋亡途徑?？赏ㄟ^進一步檢測caspase-9、caspase-3和caspase-7的表達來驗證。

Aurora激酶是有絲分裂過程中關鍵性調節(jié)酶[11]，在哺乳動物中的Aurora激酶包括3個家族成員，即Aurora A、Aurora B、Aurora C。Aurora A主要參與調節(jié)中心體成熟和分離，促進有絲分裂紡錘體裝配，同時可通過調控cyclin B/CDK1復合物來干預細胞有絲分裂。Aurora B可調控紡錘體穩(wěn)定性和染色體凝結、排列及胞質分裂。目前關于Aurora C的功能尚無明確的研究證據。多項研究發(fā)現(xiàn)，Aurora激酶在包括肝癌等諸多腫瘤中高表達[12-14]，因此，Aurora激酶成為抗腫瘤的重要靶點之一。Reversine作為一種新型Aurora激酶的抑制劑，在肝癌中是否可通過抑制Aurora激酶活性來干預肝癌細胞的有絲分裂，導致肝癌細胞周期阻滯，從而抑制肝癌細胞增殖，有待于進一步探討。此外，在活體內reversine是否同樣可以抑制腫瘤生長，也可通過裸鼠成瘤模型來驗證。

綜上所述，reversine可以有效抑制肝癌細胞HepG2的增殖和克隆形成，并誘導肝癌細胞發(fā)生凋亡，從而抑制肝癌HepG2細胞的生長，但其深入的機制有待于進一步研究。

(致謝：本研究是在廈門大學附屬東方醫(yī)院中心實驗室完成，在此致以由衷的感謝！)