李葉麗，廖 婭，錢志強(qiáng)，朱 玲，李意奇，楊丹莉

(1. 遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；2. 遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)藥理學(xué)教研室，廣東 珠海 519041)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension, PAH)是以肺動(dòng)脈重構(gòu)、肺小動(dòng)脈痙攣為主要特征的一種惡性心血管疾病。其中，肺動(dòng)脈重構(gòu)是PAH最常見的病理表現(xiàn)，也是PAH形成的重要標(biāo)志[1-2]。肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖與凋亡失衡是肺動(dòng)脈腔變窄、肺血管阻力增加，引發(fā)肺動(dòng)脈重構(gòu)的重要原因[2-3]。近年研究表明，在野百合堿(monocrotaline, MCT)誘導(dǎo)的PAH模型中，肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞明顯增殖，且加重了肺動(dòng)脈重構(gòu)的發(fā)生[3-4]。因此，抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡是抑制肺動(dòng)脈重構(gòu)、治療PAH的關(guān)鍵。淫羊藿次苷Ⅱ(icarisideⅡ, ICSⅡ)是小檗科植物淫羊藿的主要活性成分之一，具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗衰老等作用[5-7]。已有研究表明，ICSⅡ?qū)Χ喟l(fā)性骨髓瘤細(xì)胞U266、肝母細(xì)胞瘤HepG2等多種腫瘤細(xì)胞均具有促凋亡作用[8-10]。故本課題組推測(cè)，ICSⅡ可能對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞也有促凋亡的作用。因此，本研究以MCT誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈重構(gòu)大鼠為研究對(duì)象，觀察ICSⅡ?qū)Ψ蝿?dòng)脈重構(gòu)的作用，并探討其機(jī)制是否與促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的凋亡有關(guān)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物及試劑SD大鼠，♂，體質(zhì)量(210±10)g，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)，許可證號(hào)：SCXK(渝)2012-0005。ICSⅡ(純度≥98%，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，結(jié)構(gòu)式見Fig 1)；MCT(純度≥98%，美國(guó)Sigma公司)；TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(德國(guó)Roche公司)；Bax、Bcl-2、活化的caspase-3抗體(美國(guó)Abcam公司)；HRP 標(biāo)記的β-actin抗體(上?？党缮锛夹g(shù)有限公司)；ECL發(fā)光劑(七海生物有限公司)。

1.2儀器Mini-PROTEAN3電泳儀、Mini Trans-Blot Turbo轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、CCD成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；Olympus光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3MCT的配制稱取0.5 g MCT溶于10 mL 0.5 mo1·L-1的鹽酸中，用0.5 mo1·L-1氫氧化鈉調(diào)pH至7.4，加生理鹽水定容至50 mL。

1.4實(shí)驗(yàn)分組、造模及給藥40只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(Control)、模型組(Model)、ICSⅡ低劑量組(ICSⅡ-L，4 mg·kg-1)、ICSⅡ中劑量組(ICSⅡ-M，8 mg·kg-1)、ICSⅡ高劑量組(ICSⅡ-H，16 mg·kg-1)，每組8只。對(duì)照組經(jīng)頸背部一次性皮下注射生理鹽水5 mL·kg-1，其余4組注射MCT 50 mg·kg-1誘導(dǎo)肺動(dòng)脈重構(gòu)模型。ICSⅡ各劑量組于造模后d 1開始每天灌胃給藥，至d 28結(jié)束。空白組和模型組灌胃給予等量溶媒。

Fig 1 The structural formula of ICS Ⅱ

1.5肺小動(dòng)脈形態(tài)學(xué)觀察取各組大鼠左肺遠(yuǎn)離肺門處5 mm左右的肺組織，于4%甲醛溶液中固定48 h后，脫水、包埋、切片，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察肺小動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化，并拍照記錄。

1.6肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡的檢測(cè)TUNEL法測(cè)定肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡，光鏡下觀察每組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算400倍視野下凋亡細(xì)胞數(shù)目占總細(xì)胞數(shù)的百分比。其中正常細(xì)胞核顯藍(lán)色，凋亡陽(yáng)性細(xì)胞核呈棕黃色或褐色。

1.7肺組織Bax、Bcl-2、活化的caspase-3蛋白的檢測(cè)取各組肺組織約100 mg，提取總蛋白后采用BCA法定量。12%的SDS-PAGE凝膠電泳分離后，半干轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫封閉2 h后，加入一抗Bax(1 ∶1 000稀釋)、Bcl-2(1 ∶1 000稀釋)、活化的caspase-3(1 ∶5 000稀釋)、β-actin(1 ∶5 000稀釋)4℃孵育16 h，室溫孵育二抗1 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，Quantity One定量分析軟件進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1ICSⅡ?qū)CT所致大鼠肺小動(dòng)脈形態(tài)學(xué)的影響對(duì)肺小動(dòng)脈形態(tài)初步觀察發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組大鼠肺小動(dòng)脈中膜及管壁增厚、管腔狹窄、血管周圍及肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。與模型組相比，ICSⅡ給藥組大鼠肺小動(dòng)脈中膜及管壁變薄、管腔增大、血管周圍及肺間質(zhì)炎癥減輕(Fig 2)。

2.2ICSⅡ?qū)CT所致大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡的影響如Fig 3所示，與對(duì)照組相比，模型組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比率升高(P<0.05)。與模型組相比，ICSⅡ中、高劑量組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡數(shù)均明顯增加，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比率升高(P<0.05)。

2.3ICSⅡ?qū)CT所致大鼠肺組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響如Fig 4所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠肺組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，Bax/Bcl-2的比值升高(P<0.05)。與模型組相比，ICSⅡ中、高劑量組大鼠肺組織Bax蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，Bax/Bcl-2的比值升高(P<0.05)。

2.4ICSⅡ?qū)CT所致大鼠肺組織活化的caspase-3水平的影響如Fig 5所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠肺組織活化的caspase-3的水平升高 (P<0.05)。與模型組相比，ICSⅡ中、高劑量組大鼠肺組織活化的caspase-3的水平明顯升高(P<0.05)。

3 討論

隨著對(duì)PAH研究的不斷深入，肺動(dòng)脈重構(gòu)在PAH中的作用日益受到重視。肺動(dòng)脈重構(gòu)是不同原因所致PAH的共同病理生理基礎(chǔ)，亦是近年P(guān)AH發(fā)病機(jī)制的主要研究方向。本研究采用MCT誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈重構(gòu)模型，觀察ICSⅡ?qū)Ψ蝿?dòng)脈重構(gòu)的作用，并探討其機(jī)制是否與促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的凋亡有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比，模型組肺小動(dòng)脈中膜明顯增厚、管腔變窄、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，提示模型成功，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]。與模型組比，ICSⅡ給藥組大鼠肺小動(dòng)脈中膜變薄、管腔增大、炎癥減輕，提示ICSⅡ具有抗MCT所致大鼠肺動(dòng)脈重構(gòu)的作用。

Fig 2 Effect of ICS Ⅱ on pulmonary histomorphology induced by MCT in rats(×200)

Fig 3 Effect of ICS Ⅱ on pulmonary arterysmooth muscle cell apoptosis inducedby MCT in rats(×400)

Fig 5 Effect of ICS Ⅱ on the expression of apoptosis-relatedprotein activated caspase-3 in MCT-induced

#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsmodel

為進(jìn)一步探討ICSⅡ抗肺動(dòng)脈重構(gòu)的作用機(jī)制，本研究采用TUNEL染色觀察了ICSⅡ?qū)CT所致大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比，給予ICSⅡ后大鼠的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡明顯增加，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比率升高。提示ICSⅡ抗肺動(dòng)脈重構(gòu)的作用與促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的凋亡有關(guān)。細(xì)胞凋亡是外界刺激和細(xì)胞自身因素共同作用的結(jié)果。Bcl-2家族是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要因子，按其功能可分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩種。Bax是Bcl-2家族中主要的促凋亡蛋白，Bcl-2是主要的抗凋亡蛋白，Bax/Bcl-2的比值是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素。細(xì)胞發(fā)生凋亡的同時(shí)會(huì)引起線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活caspase-3，使caspase-3活化，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。

淫羊藿又名仙靈脾，為小檗科淫羊?qū)?EpimediumL.)植物，是中國(guó)傳統(tǒng)的益補(bǔ)中藥之一，具有“補(bǔ)肝陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、陽(yáng)益精和祛風(fēng)濕”的功效。ICSⅡ是淫羊藿的主要活性成分之一。已有研究表明，ICSⅡ可通過促進(jìn)caspase-3的活化，促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡[13]。在本研究中，與模型組比，給予ICSⅡ后肺組織Bax/Bcl-2比值增加，caspase-3的活化水平明顯上調(diào)。提示ICSⅡ促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與下調(diào)Bcl-2，上調(diào)Bax和活化的caspase-3的表達(dá)有關(guān)。

有趣的是，與對(duì)照組比，模型組肺組織中Bax/Bcl-2比值上調(diào)，caspase-3的活化水平也增加。Shi等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在MCT誘導(dǎo)的PAH模型中，模型組肺組織中Bax/Bcl-2的比值和caspase-3的活化水平均較對(duì)照組明顯上調(diào)，與本研究結(jié)果一致。分析其原因可能是由于肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的凋亡速率遠(yuǎn)低于其增殖速率，也可能與肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡有關(guān)。內(nèi)皮細(xì)胞損傷是引發(fā)肺動(dòng)脈重構(gòu)的起始因素，也是導(dǎo)致肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞異常增殖及凋亡受阻的重要原因[14]，故在本研究中即使肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞發(fā)生了凋亡，但肺動(dòng)脈重構(gòu)依然明顯。

(致謝：本文所有實(shí)驗(yàn)均在遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室完成，感謝實(shí)驗(yàn)室所有老師的支持與幫助。)