施子祿, 鄭丹丹, 黃秋虹, 張素萍, 黃 倩

(1. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院腎內(nèi)科，福建 泉州 362000；2. 泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部生理學(xué)教研室，福建 泉州 362100；3. 浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理系，浙江 杭州 310058)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)作為糖尿病患者最常見的微血管并發(fā)癥之一，由于其后期并發(fā)的腎衰竭最終增加患者死亡率而備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，DN形成過程復(fù)雜，涉及多種病理機(jī)制，如腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)過度激活、氧化應(yīng)激損傷、慢性炎癥、凋亡、腎臟纖維化等[1-3]，其中慢性炎癥是重要環(huán)節(jié)之一。DN患者體內(nèi)炎癥信號(hào)被激活，直接或間接引起腎臟組織損傷，加速DN的進(jìn)展。

糖尿病狀態(tài)下，循環(huán)RAS被抑制，腎臟RAS被激活，而腎臟RAS的激活是導(dǎo)致終末期腎衰竭的核心因素[4]。血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)是RAS系統(tǒng)的重要成員，其在糖尿病誘導(dǎo)的臟器損傷中發(fā)揮重要作用。替米沙坦(telmisartan)為新型的Ang II受體1(AT1)拮抗劑，通過阻斷Ang II與AT1受體的結(jié)合而廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的治療[5]。Chemerin是2007年發(fā)現(xiàn)的一種由脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，具有促進(jìn)炎癥細(xì)胞聚集，參與慢性炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化，參與糖代謝，增強(qiáng)脂肪組織胰島素敏感性等多種功能[6]。研究發(fā)現(xiàn)，同為沙坦類藥物的厄貝沙坦，可能通過抑制RAS系統(tǒng)的活化、減少腎臟局部Ang II的生成，從而對糖尿病大鼠腎臟起確切的保護(hù)作用[6]。現(xiàn)已知，替米沙坦成功減輕了db/db小鼠心肌組織炎癥反應(yīng)[7]，但能否減輕2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)小鼠腎臟炎癥損傷發(fā)揮腎臟保護(hù)作用，目前國內(nèi)外尚無相關(guān)報(bào)道。本研究通過構(gòu)建T2DM小鼠模型，探討替米沙坦對T2DM小鼠腎臟炎癥反應(yīng)的影響，并從Chemerin角度探討其腎臟保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年♂C57BL/6小鼠，8周齡，清潔級(jí)，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK滬2007-0005。標(biāo)準(zhǔn)條件飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，適宜溫度、濕度，黑暗和光照各12 h。

1.2試劑鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(美國Sigma公司，批號(hào)：S0130)；替米沙坦(美國Sigma公司，批號(hào)：T8949)；普通飼料與高脂飲食購自北京華埠康公司；小鼠Ang II酶聯(lián)免疫(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(上?；鈱?shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：BIO-JM-1314)；小鼠白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、小鼠白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、小鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA試劑盒，均購自北京安迪華泰科技有限公司，批號(hào)分別為M0627、M0111、M0314；Chemerin蛋白抗體(批號(hào)：ab203040)、β-actin抗體(批號(hào)：ab8227)均購自Abcam公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：A0208)。

1.3儀器石蠟切片機(jī)(德國Leica公司)；XR210全自動(dòng)生化分析儀(廣東中山新銳醫(yī)療設(shè)備科技有限公司)；5810R高速冷凍式離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；UVmini-1240紫外可見分光光度計(jì)(日本島津國際貿(mào)易上海有限公司)；垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司)；Tanon 3500全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

1.4方法

1.4.1糖尿病小鼠模型的建立及分組 40只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成2組：正常對照組10只和T2DM模型組30只。正常對照組小鼠接受普通飼料(66.5%碳水化合物、4.5%脂肪、18.9%蛋白質(zhì))飼養(yǎng)4周，模型組小鼠接受高脂飲食(40.9%碳水化合物、24.2%脂肪、23.8%蛋白質(zhì))飼養(yǎng)4周。4周后，小鼠禁食不禁水12 h，單次腹腔注射STZ(40 mg·kg-1，溶于新鮮配制的0.1 mmol·L-1的無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，pH 4.5)，繼續(xù)高脂飲食飼養(yǎng)，正常對照組小鼠注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，繼續(xù)普通飼料飼養(yǎng)。注射STZ 1周后，斷尾取血測空腹血糖(fasting blood-glucose，F(xiàn)BG)，2次FBG均≥16.7 mmol·L-1為T2DM造模成功[8]，T2DM模型小鼠再隨機(jī)分為T2DM組、替米沙坦(1、3 mg·kg-1)組[9]，每組10只，連續(xù)灌胃給藥8周，正常對照組和T2DM組小鼠僅使用等體積生理鹽水灌胃，8周末無小鼠死亡。

1.4.2FBG、24 h尿微量白蛋白、血清肌酐和尿素氮含量的測定 8周末實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每只小鼠置于獨(dú)立代謝籠中，禁食6 h后剪尾取血，采用血糖儀檢測FBG；收集24 h尿液，采用全自動(dòng)生化分析儀測定24 h尿微量白蛋白(microalbuminuria，mAlb)含量；0.8%戊巴比妥鈉(70 mg·kg-1)麻醉小鼠，下腔靜脈取血，制備血清，采用全自動(dòng)生化分析儀測定血清肌酐(serum creatinine，Scr)和尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)含量。

1.4.3腎臟HE染色 取各組小鼠相同部位腎組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片(3 μm厚)，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察腎臟病理變化。

1.4.4ELISA法檢測腎皮質(zhì)IL-1β、IL-6、TNF-α的水平 取各組小鼠部分腎皮質(zhì)進(jìn)行勻漿，按照各因子ELISA試劑盒的步驟進(jìn)行檢測。

1.4.5ELISA法檢測腎皮質(zhì)Ang II的濃度 切取部分冰凍腎皮質(zhì)進(jìn)行勻漿，按小鼠Ang II ELISA試劑盒說明書，檢測腎皮質(zhì)勻漿Ang II的濃度。

1.4.6腎臟免疫組織化學(xué)染色 取各組小鼠部分腎皮質(zhì)固定，脫水，石蠟包埋，脫蠟，按免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行腎皮質(zhì)Chemerin(1 ∶500)染色，光鏡下觀察腎皮質(zhì)中Chemerin的分布。

1.4.7Western blot檢測腎皮質(zhì)Chemerin蛋白的表達(dá) 取各組小鼠冰凍腎皮質(zhì)，按照相應(yīng)比例加入預(yù)冷的組織蛋白裂解液，玻璃勻漿器勻漿，充分裂解，14 000×g離心5 min，取上清，提取腎皮質(zhì)總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，分別加入一抗(Chemerin 1 ∶500稀釋，β-actin 1 ∶3 000稀釋)，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體(1 ∶2 000稀釋)，ECL發(fā)光、顯影，β-actin為內(nèi)參對照，以與β-actin的比值作為Chemerin蛋白的相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1替米沙坦對T2DM小鼠生化指標(biāo)的影響如Tab 1所示，與正常對照組相比，T2DM組小鼠FBG明顯升高(P<0.01)，替米沙坦組與T2DM組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。mAlb、Scr和BUN能夠反映小鼠的腎功能，與正常對照組相比，T2DM組小鼠在飼養(yǎng)8周后，mAlb、Scr和BUN含量均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，2個(gè)劑量替米沙坦干預(yù)后均可以明顯降低T2DM小鼠mAlb、Scr和BUN含量(P<0.05或P<0.01)，且高劑量替米沙坦的作用優(yōu)于低劑量替米沙坦(P<0.05)。以上結(jié)果提示糖尿病使小鼠腎功能異常，替米沙坦能夠以血糖非依賴的方式改善T2DM小鼠腎功能。

Tab 1 Effect of telmisartan on biochemical characteristics in T2DM n=10)

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsT2DM group;△P<0.05vs1 mg·kg-1telmisartan group

2.2替米沙坦對T2DM小鼠腎臟結(jié)構(gòu)的影響為了觀察替米沙坦對T2DM小鼠腎臟結(jié)構(gòu)的影響，對腎臟切片進(jìn)行HE染色。如Fig 1所示，光鏡下可見正常對照組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)完整，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊。與正常對照組相比，T2DM組小鼠腎臟組織中腎小管上皮細(xì)胞大量變性壞死、脫落，腎小管管腔明顯擴(kuò)張，間質(zhì)充血與炎癥細(xì)胞浸潤，表明T2DM小鼠腎組織炎癥損傷明顯。替米沙坦干預(yù)8周后腎臟病理損傷逐漸改善，主要表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞腫脹、壞死、脫落程度、炎癥細(xì)胞浸潤程度逐漸減輕，且高劑量替米沙坦組效果更明顯。以上結(jié)果表明，替米沙坦能夠減輕T2DM小鼠腎臟組織病理損傷。

Fig 1 Effect of telmisartan on morphological pathology of renal tissues in T2DM mice(×200)

2.3替米沙坦對T2DM小鼠腎皮質(zhì)IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影響糖尿病使腎臟內(nèi)炎性細(xì)胞迅速活化，大量表達(dá)炎性細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等，這些炎性細(xì)胞因子加重腎組織損傷，加快糖尿病進(jìn)程，因此，我們采用ELISA法檢測各組小鼠腎皮質(zhì)IL-1β、IL-6、TNF-α的水平。如Fig 2所示，與正常對照組相比，T2DM組小鼠腎皮質(zhì)IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)，給予2個(gè)劑量替米沙坦干預(yù)8周后，腎皮質(zhì)中IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯降低(P<0.05)，2個(gè)劑量替米沙坦組間比較無差異。以上結(jié)果表明，替米沙坦可以減少T2DM小鼠腎臟炎性因子表達(dá)，減輕T2DM小鼠腎臟炎癥損傷。

Fig 2 Effect of telmisartan on IL-1β, IL-6 and TNF-α levels in renal cortex of T2DM n=10)

2.4替米沙坦對T2DM小鼠腎皮質(zhì)AngII濃度的影響Ang II是RAS系統(tǒng)最重要的組成部分，因此我們檢測了腎皮質(zhì)中Ang II的濃度。如Fig 3所示，T2DM組小鼠腎皮質(zhì)中Ang II濃度較對照組升高(P<0.01)，2個(gè)劑量替米沙坦干預(yù)后均可以明顯降低Ang II濃度(P<0.01)，且2個(gè)劑量替米沙坦組間比較無差異。提示替米沙坦能夠抑制腎臟局部RAS系統(tǒng)。

Fig 3 Effect of telmisartan on Ang II concentration in renal cortex of T2DM n=10)

2.5替米沙坦對T2DM小鼠腎皮質(zhì)Chemerin蛋白分布的影響為了觀察替米沙坦對T2DM小鼠腎臟炎癥反應(yīng)的作用，我們對腎臟切片進(jìn)行Chemerin免疫組化染色。如Fig 4所示，對照組腎小管上皮細(xì)胞中Chemerin蛋白少量、散在分布，T2DM組小鼠腎小管上皮細(xì)胞中陽性分布明顯增多，以胞質(zhì)中最明顯，替米沙坦干預(yù)后Chemerin蛋白分布逐漸減少。

Fig 4 Telmisartan protein distribution of renal cortex in T2DM mice(×200)

2.6替米沙坦對T2DM小鼠腎皮質(zhì)Chemerin蛋白表達(dá)的影響如Fig 5所示，T2DM小鼠腎皮質(zhì)Chemerin蛋白表達(dá)水平較對照組明顯增加(P<0.05)，2個(gè)劑量替米沙坦干預(yù)后，腎皮質(zhì)Chemerin表達(dá)較T2DM組降低(P<0.05)，且2個(gè)劑量替米沙坦組間比較無差異。提示替米沙坦能夠改善T2DM引起的小鼠腎皮質(zhì)Chemerin蛋白的表達(dá)增加。

Fig 5 Effect of telmisartan on Chemerin expression in renal cortex of T2DM n=10)

3 討論

DN是T2DM患者常見的慢性并發(fā)癥之一，也是終末期腎衰竭的主要病因，其病理機(jī)制復(fù)雜，涉及多種因素，炎癥反應(yīng)可能在其中起關(guān)鍵作用[3]。研究證實(shí)，高糖誘導(dǎo)的腎組織炎癥反應(yīng)對腎臟損害尤為重要，因此，減輕腎組織炎癥反應(yīng)有利于改善糖尿病腎臟功能，減緩糖尿病病程進(jìn)展[10]。

在糖尿病db/db小鼠模型中，替米沙坦同類藥厄貝沙坦的慢性治療能夠抑制心臟RAS系統(tǒng)以及NF-κB的表達(dá)，減輕心肌組織炎癥反應(yīng)[11]。替米沙坦短期治療也可通過抑制眼組織局部的RAS系統(tǒng)，緩解糖尿病誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜炎性損傷[12]，但對糖尿病引起的腎組織炎癥反應(yīng)的影響，目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究采用高脂飲食聯(lián)合STZ構(gòu)建T2DM，結(jié)果顯示，替米沙坦能夠明顯降低T2DM小鼠mAlb、Scr及BUN水平，但FBG水平未下降，提示替米沙坦以血糖非依賴的方式改善T2DM小鼠腎功能。同時(shí)，替米沙坦還可改善腎臟病理學(xué)變化，減少炎癥細(xì)胞浸潤。

糖尿病時(shí)，腎組織局部RAS活性明顯上升，而Ang II是RAS系統(tǒng)的重要成員，研究發(fā)現(xiàn)Ang II可間接介導(dǎo)一系列炎癥反應(yīng)，也可直接通過刺激炎性細(xì)胞釋放炎癥因子、細(xì)胞因子等，引起腎組織慢性炎癥反應(yīng)而影響DN進(jìn)展[4]。Mezzano等[13]對10例DN患者進(jìn)行腎活檢，并采用免疫組化技術(shù)檢測Ang II的分布表達(dá)，結(jié)果在腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)了高表達(dá)的Ang II，這些高表達(dá)的Ang II通過刺激腎小管上皮細(xì)胞，誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化蛋白-1等前炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，從而啟動(dòng)腎臟炎癥過程。本研究中，小鼠腎皮質(zhì)ELISA結(jié)果證實(shí)，T2DM中Ang II濃度明顯升高，不同劑量替米沙坦干預(yù)均可使Ang II濃度明顯降低，腎皮質(zhì)炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低，進(jìn)一步證實(shí)了腎臟局部RAS系統(tǒng)在T2DM小鼠腎臟炎癥反應(yīng)中的作用。

Chemerin是近年來發(fā)現(xiàn)的具有參與脂肪細(xì)胞脂質(zhì)代謝調(diào)控的新型脂肪因子，其可通過旁分泌途徑作用于巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞，參與炎癥反應(yīng)。文獻(xiàn)報(bào)道，在T2DM模型大鼠腎組織中Chemerin表達(dá)明顯升高，而且其水平的高低與腎臟炎癥因子緊密相關(guān)[14]。同樣，在T2DM伴患者血清中也檢測出高水平Chemerin[15]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，T2DM小鼠腎皮質(zhì)中Chemerin蛋白的分布增多、表達(dá)明顯升高，進(jìn)一步提示Chemerin與T2DM的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。給予替米沙坦干預(yù)后，小鼠腎皮質(zhì)中Chemerin蛋白的分布減少、表達(dá)下降，表明替米沙坦可能是通過抑制Chemerin蛋白的分布、表達(dá)改善T2DM小鼠腎臟炎癥反應(yīng)。

綜上所述，替米沙坦能夠以血糖非依賴的方式改善T2DM小鼠腎功能，減少腎皮質(zhì)中炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平，這種作用可能是通過抑制腎皮質(zhì)Ang II的生成，進(jìn)而抑制腎臟局部RAS，以及抑制Chemerin蛋白的分布、表達(dá)，減輕T2DM小鼠腎臟炎癥反應(yīng)，最終改善腎組織的病理性損傷，為臨床干預(yù)DN的發(fā)生和發(fā)展提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

(致謝：本文所有實(shí)驗(yàn)均在泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校微血管生理調(diào)控實(shí)驗(yàn)中心完成，特別感謝對課題給予指導(dǎo)及幫助的老師。)