屠夢(mèng)玨，魏進(jìn)歌，陳 鑫,2，王玉琴

(1. 南通大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南通 226001；2. 鹽城市第一人民醫(yī)院藥劑科，江蘇 鹽城 224005)

肝臟是機(jī)體重要的新陳代謝和解毒器官，容易被一些化學(xué)物質(zhì)如酒精、四氯化碳和對(duì)乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)損傷[1-2]，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死和肝功能障礙。APAP是一種常用的非處方藥，在治療劑量下是安全的，但越來(lái)越多的臨床試驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究證實(shí)，APAP過(guò)量可引起急性肝衰竭[3]。治療劑量時(shí)，APAP主要在肝臟被葡萄醛酸化和硫酸化，代謝為無(wú)毒的水溶性代謝產(chǎn)物，只有極少部分APAP被代謝成為有毒性的活性產(chǎn)物N-乙酰-對(duì)苯醌亞胺(N-acetyl-q-benzoquinone imine，NAQPI )。 NAQPI可以與谷胱甘肽(glutathione，GSH)結(jié)合，形成APAP-谷胱甘肽、APAP-半胱氨酸和APAP-N-乙酰半胱氨酸來(lái)解毒。但是，當(dāng)APAP過(guò)量導(dǎo)致NAQPI產(chǎn)生過(guò)多，繼而耗竭細(xì)胞內(nèi)GSH后，剩余的NAPQI 可以共價(jià)結(jié)合細(xì)胞生物大分子形成NAQPI-蛋白質(zhì)加合物，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，線粒體功能障礙和細(xì)胞核DNA斷裂，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死和肝損傷[4]。

臨床上對(duì)于APAP過(guò)量導(dǎo)致肝損傷的治療，除了N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)之外，目前亦無(wú)其他有效藥物。二氫楊梅素(dihydromyricetin， DHM)，3,5,7,3′,4′,5′-六羥基2,3-二氫黃酮醇，又名蛇葡萄素，是一種重要的黃酮醇化合物，來(lái)源廣泛，存在于葡萄科、楊梅科、藤黃科、柳科等植物中，在藤茶屬植物中含量最高。DHM具有多種藥理學(xué)活性，如抗炎、抗氧化、護(hù)肝、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)脂質(zhì)及血糖代謝等[5]。既往研究發(fā)現(xiàn)，DHM能夠抑制由氨基半乳糖誘導(dǎo)的大鼠乳酸脫氫酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)水平的升高，具有較好的肝保護(hù)作用。DHM體外對(duì)于小鼠肝臟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶有抑制作用[6]，體內(nèi)能夠升高乙醇誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型肝臟還原性胱甘肽水平，降低肝臟丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平，通過(guò)清除氧自由基、提高肝細(xì)胞的抗氧化能力，對(duì)乙醇性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用[7]。本實(shí)驗(yàn)研究預(yù)防性給予DHM對(duì)APAP誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的影響，并探討了其可能的作用機(jī)制。若能證實(shí)DHM干預(yù)對(duì)于APAP損傷的肝臟有保護(hù)效應(yīng)，則可能為其實(shí)際應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。

1 材料

1.1藥物與試劑DHM(西安自然生物技術(shù)有限公司，批號(hào)161106,純度>98%)；APAP(Abcam公司，Lot.APN12278-1-1, 純度>98%)；雙環(huán)醇片(bicyclol，批號(hào)170205, 北京協(xié)和藥廠)；ALT、AST、GSH、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)及MDA檢測(cè)試劑盒(南京建成生物有限公司)；p-JNK、JNK、Bax一抗(CST公司)；α-tubulin一抗、抗兔及抗鼠二抗(Proteintech公司)；活性氧(reactive oxygen species, ROS)熒光探針-DHE(北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司)；PrimeScriptTMRT reagent kit試劑盒、SYBR GREEN(TaKaRa公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、PMSF和RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)C57BL/6小鼠，♂，6周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)買并飼養(yǎng)于南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由飲食，動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK(蘇)2012-0031。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照國(guó)家和南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物使用管理?xiàng)l例進(jìn)行。

1.3儀器PowerWaveX340型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)；電泳、轉(zhuǎn)膜及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；ABI7500熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystem公司)；冰凍切片機(jī)(Leica公司)；OLYMPUS DP72熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥24只C57BL/6小鼠，自由飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組(Control)、模型組(Model)、DHM 300 mg·kg-1組、陽(yáng)性對(duì)照藥雙環(huán)醇200 mg·kg-1組(bicyclol 200 mg·kg-1)，每組6只。按體質(zhì)量10 mL·kg-1灌胃給藥，每天1次，對(duì)照組與模型組每天灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)7 d。末次給藥禁食(不禁水)24 h后，除對(duì)照組外，每組小鼠腹腔注射300 mg·kg-1APAP生理鹽水溶液(10 mL·kg-1)[3-4]；對(duì)照組給予相同體積生理鹽水腹腔注射。APAP腹腔注射4 h后，眼眶后靜脈叢取血，處死小鼠。生理鹽水灌注心臟后取肝臟組織，部分經(jīng)4%多聚甲醛固定，用于組織病理學(xué)檢測(cè)，另一部分組織-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2小鼠血清ALT和AST水平檢測(cè)各組小鼠眼眶后靜脈叢取血，室溫靜置30 min后，血液凝固，3 000 r·min-1離心10 min，取上清，-80℃保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，酶標(biāo)儀于不同波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品濃度。

2.3小鼠肝臟ROS熒光探針-DHE染色新鮮切取小鼠肝臟，用OCT冰凍切片包埋劑包埋后，迅速冷凍固定，切片。用稀釋到合適濃度的ROS熒光探針室溫避光孵育1 h，PBS清洗后滴加防淬滅劑封片。通過(guò)熒光顯微鏡觀察，拍照。

2.4小鼠肝臟組織中GSH、MDA含量及SOD活力測(cè)定取約100 mg小鼠肝臟組織塊，加入9倍體積的生理鹽水，在冰浴中勻漿后，4℃、2 500 r·min-1離心15 min，吸取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取勻漿上清液0.1 mL，加0.1 mL試劑一混勻，4℃、3 500 r·min-1離心10 min，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定吸光度值，計(jì)算樣品濃度。

2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)小鼠肝組織IL-6、TNF-α、IL-1βmRNA表達(dá)取100 mg肝組織勻漿，TRIzol法提取總RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent kit試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，隨后采用20 μL反應(yīng)體系通過(guò)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。所用引物序列如下：IL-6：(Forward)5′-UCCACTTCACAAGTCGGAGGCTTA-3′，(Reverse)5′-CCAGTTTGGTAGCATCCATCATTTC-3′；TNF-α：(Forward)5′-CACCATGAGCACAGAAAGCA-3′，(Reverse)5′-TAGACAGAAGAGCGTGGTGG-3′；IL-1β：(Forward)5′-ACTCATTGTGGCTGTGGAGA-3′，(Reverse)5′-TTGTTCATCTCGGAGCCTGT-3′；GAPDH：(Forward)5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，(Reverse)5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

2.6Westernblot檢測(cè)小鼠肝臟組織中Bax、p-JNK及JNK蛋白表達(dá)取100 mg肝組織，加入1 mL預(yù)冷的RIPA裂解液，勻漿后提取總蛋白，用BCA法定量。每組取40 μg蛋白進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入相應(yīng)一抗，4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，ECL發(fā)光，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)掃描，Image J軟件測(cè)定條帶灰度值，以目的條帶和內(nèi)參比值用于統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1DHM預(yù)處理減輕了APAP誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷血清ALT和AST水平反映了小鼠肝細(xì)胞的損傷程度。與正常對(duì)照組相比，在經(jīng)APAP處理后，模型組小鼠血清ALT和AST水平明顯升高(P<0.01)，說(shuō)明APAP腹腔注射誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷造模成功。與模型組相比，DHM和陽(yáng)性對(duì)照藥雙環(huán)醇可以明顯抑制APAP誘導(dǎo)的AST水平增加(P<0.05)；對(duì)于升高的ALT水平，DHM和雙環(huán)醇也有一定抑制效應(yīng)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 1A、1B)。進(jìn)一步通過(guò)HE染色觀察小鼠肝組織損傷情況，如Fig 1C所示，模型組小鼠肝臟出現(xiàn)大量空泡狀肝細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；預(yù)先給予小鼠DHM和雙環(huán)醇能明顯減少空泡狀肝細(xì)胞數(shù)量，并減少了炎性細(xì)胞在局部病灶的聚集、浸潤(rùn)。同時(shí)，各組小鼠肝臟指數(shù)無(wú)明顯差異(Fig 1D)。

Fig 1 Pretreatment of DHM alleviated APAP-induced acute liver injury in Serum AST(A) and ALT(B), histopathologic examination(C,×200) and liver ratio of weight(D) were used for the measurement of liver injury.##P<0.01 vs control group;*P<0.05 vs model group

3.2DHM預(yù)處理降低了APAP小鼠肝組織MDA及ROS水平MDA反映了組織的脂質(zhì)過(guò)氧化水平，由Fig 2A可知，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肝組織MDA水平明顯升高(P<0.05)，提示模型組小鼠存在明顯的氧化應(yīng)激損傷。進(jìn)一步對(duì)小鼠肝臟冰凍切片進(jìn)行ROS熒光探針-DHE染色，如Fig 2B所示，模型組小鼠肝臟熒光強(qiáng)度明顯增加，說(shuō)明組織中ROS水平較高。預(yù)先給予小鼠DHM能明顯降低肝組織MDA水平(P<0.05)，明顯減弱組織熒光強(qiáng)度。提示DHM對(duì)于APAP肝損傷的保護(hù)作用可能與減少ROS產(chǎn)生、減輕氧化應(yīng)激有關(guān)。

3.3DHM預(yù)處理升高了小鼠肝組織GSH水平及SOD活力APAP過(guò)量時(shí)產(chǎn)生大量具有高度親電子活性的中間產(chǎn)物NAPQI，消耗胞內(nèi)GSH。當(dāng)80%～90% GSH被消耗后，過(guò)多的NAPQI就會(huì)和肝細(xì)胞蛋白共價(jià)結(jié)合形成半胱氨酸加和物，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)、線粒體損傷等胞內(nèi)過(guò)程，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。如Fig 3所示，APAP模型組GSH水平明顯降低(P<0.01)，說(shuō)明肝細(xì)胞內(nèi)GSH被消耗，而DHM和雙環(huán)醇能抑制這種消耗(P<0.05)，對(duì)肝細(xì)胞起保護(hù)作用。此外，SOD活力反映了細(xì)胞對(duì)自由基的清除能力，APAP明顯降低了小鼠肝組織中SOD活力(P<0.01)，而DHM組和雙環(huán)醇組SOD活力較模型組明顯升高(P<0.05)。這些結(jié)果提示，DHM可通過(guò)增加GSH水平和SOD活力來(lái)保護(hù)受到APAP損傷的肝細(xì)胞。

3.4DHM預(yù)處理降低了小鼠肝組織炎癥相關(guān)因子IL-6、TNF-α、IL-1βmRNA水平如Fig 4所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA水平均明顯升高(P<0.01)；DHM和雙環(huán)醇均可以降低模型組肝臟中升高的IL-6、TNF-α mRNA水平(P<0.05)，對(duì)升高的IL-1β mRNA水平也有抑制作用，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示，DHM和雙環(huán)醇可減輕APAP引起的炎癥反應(yīng)。

Fig 2 Pretreatment of DHM decreased levels of MDA(A)and ROS(B) in liver of APAP-treated

#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsmodel group

4 討論

APAP作為臨床上應(yīng)用廣泛的解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥，大劑量或長(zhǎng)期服用可能會(huì)造成肝損傷。本實(shí)驗(yàn)采用APAP誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型，觀察DHM預(yù)防性干預(yù)對(duì)受損肝組織的效應(yīng)，并推測(cè)其可能的作用機(jī)制。

Fig 3 Pretreatment of DHM increased GSH level(A) andSOD activity(B) in liver of APAP-treated

Fig 4 Pretreatment of DHM decreased mRNA levels of IL-6,TNF-α and IL-1β in liver of APAP-treated

APAP主要在肝臟進(jìn)行代謝，正常情況下，大多數(shù)迅速被葡萄糖醛酸化或被硫酸化，轉(zhuǎn)化為無(wú)毒性代謝產(chǎn)物[7-9]；過(guò)量則大量消耗GSH，形成半胱氨酸加合物，引發(fā)嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)、線粒體損傷、激酶通路激活等[10]，最終引起肝細(xì)胞死亡。在本文中，模型組小鼠因過(guò)量APAP作用而導(dǎo)致肝組織GSH水平明顯降低，氧化應(yīng)激損傷明顯，這些結(jié)果都與之前文獻(xiàn)報(bào)道一致；而DHM干預(yù)能明顯升高小鼠肝組織GSH水平及SOD活力，緩解由過(guò)量APAP導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損害。這些證據(jù)表明，DHM對(duì)于肝細(xì)胞的保護(hù)作用可能與其具有較強(qiáng)抗氧化作用，并能提高細(xì)胞內(nèi)GSH水平有關(guān)。

Fig 5 Pretreatment of DHM decreased JNK phosphorylation andBax protein expression in liver of APAP-treated

據(jù)報(bào)道，除了氧化應(yīng)激之外，APAP肝毒性與炎癥反應(yīng)也密切相關(guān)。APAP代謝產(chǎn)物亦會(huì)導(dǎo)致肝臟枯否細(xì)胞活化，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和大量炎癥細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-6等產(chǎn)生，引發(fā)了炎癥反應(yīng)[11]。炎癥反應(yīng)募集炎性細(xì)胞至肝臟，進(jìn)一步促進(jìn)產(chǎn)生大量有毒性的ROS，加重氧化應(yīng)激損傷。在本實(shí)驗(yàn)中，APAP模型組小鼠肝組織TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA水平較對(duì)照組明顯升高，DHM干預(yù)能明顯降低升高的炎癥相關(guān)因子mRNA水平，提示其對(duì)肝臟的保護(hù)作用除了與抗氧化作用有關(guān)之外，亦與其具有抗炎作用相關(guān)。

嚴(yán)重氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致JNK途徑的激活，并引起JNK磷酸化水平增高，并將JNK轉(zhuǎn)移到線粒體[12]。JNK遷移到線粒體能明顯增強(qiáng)線粒體氧化應(yīng)激，刺激線粒體功能障礙和開(kāi)孔[13]，線粒體膜蛋白如細(xì)胞凋亡因子和內(nèi)切核酸酶G的泄漏，直接攻擊DNA，最終導(dǎo)致細(xì)胞DNA裂解和細(xì)胞死亡[14]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到APAP模型組JNK磷酸化蛋白的明顯增高，DHM對(duì)這種APAP誘導(dǎo)的磷酸化升高有抑制效應(yīng)。JNK磷酸化和氧化應(yīng)激同時(shí)也激活許多不同的細(xì)胞凋亡相關(guān)的Bcl-2家族蛋白，主要包括Bax蛋白等[15]。Bax是一個(gè)促凋亡因子，被激活表達(dá)增加后，會(huì)促使細(xì)胞凋亡發(fā)生。Western blot法檢測(cè)肝組織中Bax蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在APAP模型組中其表達(dá)明顯升高，而DHM的干預(yù)能夠降低Bax蛋白表達(dá)水平。結(jié)合之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示DHM對(duì)于APAP損傷小鼠肝臟的保護(hù)作用是綜合了其抗炎、抗氧化、抑制JNK信號(hào)通路的激活以及肝細(xì)胞凋亡的結(jié)果。

綜上所述， DHM在APAP誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型中發(fā)揮抗炎和抗氧化應(yīng)激作用，進(jìn)而抑制JNK信號(hào)通路的激活，并抑制肝細(xì)胞凋亡，保護(hù)了APAP損傷的小鼠肝臟。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為DHM及其相關(guān)產(chǎn)品用于藥物性肝損傷的預(yù)防和治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在南通大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室及南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成，衷心感謝各位老師的支持和幫助。)