孫玉國，王照巖，楊玉玲，楊志一，尹崇高，李洪利

(濰坊醫(yī)學(xué)院1. 附屬醫(yī)院藥學(xué)部、2. 病理學(xué)教研室、3. 護(hù)理學(xué)院、4. 醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心，山東 濰坊 261053)

盡管近年來臨床預(yù)防篩查和治療乳腺癌的技術(shù)已獲得長足發(fā)展，乳腺癌患者預(yù)后也有明顯改善，然而，耐藥性仍是乳腺癌治療過程中不可避免的問題[1]，如阿霉素耐藥、順鉑耐藥等。阿霉素是臨床常見的化療藥之一，且越來越多的研究表明，阿霉素耐藥與微小RNA(microRNAs，miRNAs)的異常表達(dá)密切相關(guān)[2]。miRNAs作為一類調(diào)控序列，可結(jié)合mRNA序列的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)，以此調(diào)控癌細(xì)胞的耐藥增殖，如過表達(dá)miR-210抑制胰腺癌的增殖，且可通過靶基因ABCC5逆轉(zhuǎn)吉西他濱的耐藥[3]。miR-101通過抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)表達(dá)，逆轉(zhuǎn)替莫唑胺的耐藥[4]。但是關(guān)于miR-186-5p在乳腺癌細(xì)胞阿霉素耐藥性中的作用機(jī)制研究尚未見報道。本文對阿霉素耐藥株MCF-7/ADR及MCF-7細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，檢測miR-186-5p、RAB2A對耐藥增殖的影響，進(jìn)一步經(jīng)LY294002處理后，檢測p-Akt308、p-Akt473及Akt的變化，以此闡述miR-186-5p、RAB2A在乳腺癌細(xì)胞阿霉素耐藥性中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7購自ATCC。

1.1.2藥物與試劑 阿霉素由濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院提供(海正輝瑞制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H33021980)；Mir-XTMmiRNA qRT-PCR SYBR?Kit、SYBR?Green I染料，均購自TaKaRa公司；RIPA裂解液、CCK-8，購自索萊寶公司；PI3K抑制劑LY294002，購自北京碧云天公司；鼠抗人β-actin單克隆抗體、兔抗人RAB2A多克隆抗體、兔抗人p-Akt473多克隆抗體、兔抗人p-Akt308多克隆抗體，均購自Abcam公司；胎牛血清和MEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone。

1.1.3儀器 ABI7500熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)，酶標(biāo)儀(Bio-Tek公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 按照文獻(xiàn)[5,6]，MCF-7、MCF-7/ADR細(xì)胞均在含10% FBS的MEM培養(yǎng)基、5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，其中MCF-7/ADR細(xì)胞另外添加1.0 mg·L-1的阿霉素以維持其耐藥性，實(shí)驗(yàn)前48 h不再添加阿霉素。細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine 2000，具體步驟參照操作說明書。參照文獻(xiàn)[9]，細(xì)胞轉(zhuǎn)染及共轉(zhuǎn)染分組：① MCF-7組：常規(guī)培養(yǎng)，不做處理；② anti-NC/MCF-7組：轉(zhuǎn)入敲除miR-186-5p的對照質(zhì)粒；③ anti-miR-186-5P/MCF-7組：轉(zhuǎn)入敲除miR-186-5p質(zhì)粒；④ MCF-7/ADR組：MCF-7/ADR細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，不做處理；⑤ NC組：將過表達(dá)miR-186-5p的對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)入MCF-7/ADR細(xì)胞；⑥ miR-186-5p組：將過表達(dá)miR-186-5p質(zhì)粒轉(zhuǎn)入MCF-7/ADR細(xì)胞；⑦ miR-186-5p+Con組：MCF-7/ADR中同時轉(zhuǎn)入過表達(dá)miR-186-5p質(zhì)粒和過表達(dá)RAB2A質(zhì)粒的對照質(zhì)粒Con；⑧ miR-186-5p+RAB2A組：MCF-7/ADR中同時轉(zhuǎn)入過表達(dá)miR-186-5p質(zhì)粒和過表達(dá)RAB2A質(zhì)粒；⑨ Scr+anti-miR-186-5p組：MCF-7中轉(zhuǎn)入敲除RAB2A的對照質(zhì)粒和敲除miR-186-5p的質(zhì)粒；⑩ SiRAB2A+anti-miR-186-5p組：MCF-7中轉(zhuǎn)入敲除RAB2A質(zhì)粒和敲除miR-186-5p質(zhì)粒。

1.2.2雙熒光素酶實(shí)驗(yàn) 將RAB2A的3′-UTR的野生型(pGL3-RAB2A-3′UTR)和突變型(pGL3-RAB2A- 3′UTR-mut)分別與對照質(zhì)粒NC、過表達(dá)miR-186-5p質(zhì)粒、對照質(zhì)粒anti-NC、anti-miR-186-5p質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染處理。具體實(shí)驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)[7]。

1.2.3qRT-PCR 用TRIzol法提取各組乳腺癌細(xì)胞的總RNA。用莖環(huán)法和普通逆轉(zhuǎn)錄法分別對miR-186-5p和RAB2A進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得第一鏈cDNA后，分別用Mir-XTMmiRNA qRT-PCR SYBR?Kit和SYBR?Green I染料進(jìn)行qRT-PCR，miR-186-5p以U6為內(nèi)參，RAB2A以β-actin為內(nèi)參。反應(yīng)條件及miR-186-5p的莖環(huán)序列、引物序列均參照文獻(xiàn)[8]。RAB2A上游引物：5′-ACATCATAATCGGCGACACAGGTG-3′，下游引物：5′ -CATTCGAGCACCGAACTCTACACC-3′。

1.2.4Western blot MCF-7、MCF-7/ADR細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解后進(jìn)行蛋白抽提，接著進(jìn)行分離膠濃度為12%的SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗4℃孵育過夜，d 2 TBST洗膜，孵育二抗，再次洗膜后，加ECL曝光。一抗稀釋度：RAB2A(1 ∶1 000)、p-Akt308(1 ∶500)、p-Akt473(1 ∶500)、Akt(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶1 000)。

1.2.5CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取各組細(xì)胞2×103個，接種于96孔板中。貼壁培養(yǎng)24 h后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm的吸光度值。以此分別測定MCF、MCF-7/ADR細(xì)胞在轉(zhuǎn)染以及共轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h細(xì)胞增殖能力的變化。

2 結(jié)果

2.1RAB2A與miR-186-5p靶向結(jié)合通過Targetscan和miRNAMap預(yù)測軟件，得出RAB2A與miR-186-5p存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，我們采用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)，檢測RAB2A與miR-186-5p在乳腺癌阿霉素耐藥株MCF-7/ADR中是否存在結(jié)合及調(diào)控相互關(guān)系。Fig 1結(jié)果顯示，miR-186-5p可特異性地結(jié)合于RAB2A的3′UTR。

Fig 1 RAB2A, a direct target of

2.2miR-186-5p、RAB2A在各組乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)采用qRT-PCR分別檢測miR-186-5p、RAB2A在乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MCF-7/ADR中mRNA的表達(dá)情況，同時，通過Western blot檢測RAB2A的蛋白表達(dá)水平。Fig 2結(jié)果顯示，與MCF-7細(xì)胞相比，MCF-7/ADR中miR-186-5p的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，RAB2A的mRNA表達(dá)沒有明顯變化(P>0.05)，而RAB2A的蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。

2.3過表達(dá)miR-186-5p抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖為檢測miR-186-5p對乳腺癌細(xì)胞耐藥和增殖的影響，我們通過轉(zhuǎn)染使MCF-7/ADR中的miR-186-5p高表達(dá)，敲低MCF-7中的miR-186-5p，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力的變化。Fig 3結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染72 h后，與MCF-7/ADR及NC組細(xì)胞相比，miR-186-5p組細(xì)胞的增殖能力明顯降低(P<0.05)；與MCF-7及anti-NC組細(xì)胞相比，anti-miR-186-5p組細(xì)胞的增殖能力明顯增加(P<0.05)。

Fig 2 Expression levels of miR-186-5p and

2.4miR-186-5p負(fù)向調(diào)控乳腺癌細(xì)胞中RAB2A的表達(dá)Western blot檢測miR-186-5p對乳腺癌細(xì)胞中RAB2A的影響。如Fig 4所示，過表達(dá)MCF-7/ADR中的miR-186-5p及敲低MCF-7中的miR-186-5p后，與NC組細(xì)胞相比，miR-186-5p組細(xì)胞中RAB2A的表達(dá)明顯降低；與anti-NC組細(xì)胞相比，anti-miR-186-5p組細(xì)胞中RAB2A的表達(dá)明顯增加(P<0.05)。

2.5過表達(dá)RAB2A逆轉(zhuǎn)miR-186-5p抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的能力為進(jìn)一步檢測miR-186-5p是否通過作用于RAB2A，影響乳腺癌細(xì)胞的增殖，采用CCK-8檢測共轉(zhuǎn)染后RAB2A、miR-186-5p對乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響。如Fig 5所示，共轉(zhuǎn)染72 h后，與miR-186-5p+Con組細(xì)胞相比，miR-186-5p+RAB2A組細(xì)胞的增殖能力明顯增加(P<0.05)；與miR-186-5p+Scr組細(xì)胞相比，miR-186-5p+SiRAB2A組細(xì)胞的增殖能力明顯降低(P<0.05)。

Fig 3 Influence of miR-186-5p on cell proliferation in

2.6miR-186-5p負(fù)向調(diào)控RAB2A經(jīng)PI3K/Akt信號通路逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞的阿霉素耐藥和增殖為檢測miR-186-5p是否通過負(fù)向調(diào)控RAB2A，經(jīng)PI3K/Akt信號通路逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞的阿霉素耐藥和增殖，終濃度為20 μmol·L-1的 PI3K抑制劑LY294002添加到共轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，Western blot檢測p-Akt308、p-Akt473的表達(dá)水平。如Fig 6所示，在LY294002處理下，與miR-186-5p+Con組細(xì)胞相比，miR-186-5p+RAB2A組細(xì)胞的p-Akt308、p-Akt473的表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)，Akt的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化；與miR-186-5p+Scr組細(xì)胞相比，miR-186-5p+SiRAB2A組細(xì)胞的p-Akt308、p-Akt473表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，Akt的表達(dá)沒有明顯變化。

Western blot was employed to assess the expression of RAB2A in breast cancer cells after over-expression of miR-186-5p in MCF-7/ADR cells and suppression of miR-186-5p in MCF-7cells.*P<0.05 vs NC or anti-NC

Fig 5 Over-expressed RAB2A restored reduction of

3 討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，且化療是治療乳腺癌的常規(guī)手段。然而，多藥耐藥是導(dǎo)致化療失敗的主要障礙[9]。因此，研究乳腺癌的多藥耐藥機(jī)制將為臨床治療乳腺癌提供新的治療靶點(diǎn)和途徑，以期提高患者的預(yù)后。

RAB2A是小GTPase家族中的一員，參與囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的回收及運(yùn)動。研究發(fā)現(xiàn)，RAB2A與Rab27a通過雙效應(yīng)物Noc2，協(xié)同調(diào)控成熟顆粒向胞外的運(yùn)輸。Dey等[10]發(fā)現(xiàn)，S100A7可激活RAB2A介導(dǎo)的MAPK信號通路，影響口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的運(yùn)動、侵襲。此外，Luo等[11]發(fā)現(xiàn)，RAB2A激活ERK信號通路，促進(jìn)乳腺癌干細(xì)胞和腫瘤的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)通過雙熒光素酶和Western blot實(shí)驗(yàn)，首次證實(shí)miR-186-5p在阿霉素耐藥株MCF-7/ADR中存在RAB2A的結(jié)合位點(diǎn)，且RAB2A表達(dá)水平受miR-186-5p調(diào)控。

Fig 6 Over-expressed RAB2A restored effects of p-Akt308,p-Akt 473 by

近年來，大量研究表明miRNAs的失調(diào)與多藥耐藥存在密切關(guān)系。先前文獻(xiàn)表明，miR-186可靶向結(jié)合ABCB1和調(diào)節(jié)GST-π的表達(dá)，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞對紫杉醇、順鉑的耐藥性[12]。同時，miR-186經(jīng)對Twist1的調(diào)控，逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞的順鉑耐藥[13]。Ye等[14]發(fā)現(xiàn)，miR-186調(diào)控微管相關(guān)蛋白tau(microtubule-associated proteins tau,MAPT)的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌的化學(xué)耐藥性。近來發(fā)現(xiàn)，TUG1經(jīng)miR-186/CPEB2介導(dǎo)結(jié)直腸癌的甲氨蝶呤耐藥[15]。本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)，miR-186-5p靶向調(diào)控PTTG1，抑制非小細(xì)胞肺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移[8]。但是，關(guān)于miR-186-5p在乳腺癌阿霉素耐藥和增殖中的作用尚未見報道。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，阿霉素耐藥株MCF-7/ADR中miR-186-5p低表達(dá)，過表達(dá)miR-186-5p后明顯抑制增殖。過表達(dá)RAB2A后明顯逆轉(zhuǎn)了miR-186-5p對增殖的影響，同時，經(jīng)LY294002處理后，Western blot結(jié)果顯示，RAB2A明顯逆轉(zhuǎn)了miR-186-5p對p-Akt308、p-Akt473的影響。此外，我們在MCF-7細(xì)胞中獲得相同的結(jié)論。

綜上所述，miR-186-5p負(fù)向調(diào)控RAB2A，經(jīng)PI3K/Akt信號通路逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞的阿霉素耐藥和增殖，過表達(dá)RAB2A逆轉(zhuǎn)了miR-186-5p對耐藥和增殖的影響。為臨床治療阿霉素耐藥的乳腺癌患者提供新的治療靶點(diǎn)和理論支撐，以便提出更有效的治療策略。