柳 卓，趙洪慶，孟 盼，楊 蕙，向 韻，王宇紅,

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥粉體與創(chuàng)新藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，湖南 長沙 410208；2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410007)

糖尿病并發(fā)抑郁癥(diabetic depression, DD)繼發(fā)于糖尿病，具有高發(fā)病率和高危害性的特點(diǎn)，其發(fā)病率占糖尿病患者的30%-50%，自殺風(fēng)險是普通人群的8倍[1]。因而，開展DD的發(fā)病機(jī)制研究具有重要意義。前額葉皮質(zhì)是大腦邊緣系統(tǒng)的關(guān)鍵區(qū)域，主要負(fù)責(zé)感覺認(rèn)知、執(zhí)行功能、情緒調(diào)節(jié)等，研究表明，抑郁癥的發(fā)生發(fā)展與大腦前額葉皮質(zhì)損傷關(guān)系密切[2]。目前，對DD發(fā)生機(jī)制的研究幾乎都集中于海馬區(qū)，尚未涉及同樣負(fù)責(zé)調(diào)控認(rèn)知及情緒的前額葉皮質(zhì)區(qū)。越來越多的證據(jù)表明，谷氨酸(glutamate, Glu)在抑郁癥的發(fā)生過程中扮演了重要角色，其通過與代謝型谷氨酸受體2/3(metabotropic glutamate receptor 2/3, mGluR2/3)結(jié)合，激活下游細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)，進(jìn)而通過下調(diào)神經(jīng)營養(yǎng)因子合成、誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡等方式，導(dǎo)致抑郁行為的產(chǎn)生[3-5]。然而，谷氨酸能否通過該途徑介導(dǎo)DD前額葉皮質(zhì)的損傷，尚未見相關(guān)研究。因此，本研究以Glu-mGluR2/3-ERK通路為切入點(diǎn)，探討其在前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡中的作用，對深入闡明DD的發(fā)病機(jī)制具有重要研究價值。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物SPF級SD大鼠，♂，體質(zhì)量(180～220) g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK(湘)2013-0004。動物購入后，飼養(yǎng)于溫度(25±2)℃、相對濕度(50±5)%、光/暗周期12 h/12 h的SPF級環(huán)境中，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d。

1.2試劑與儀器Glu對照品(中國食品藥品檢定研究院)；LY341495(美國Sigma)；mGlu2/3、ERK、GFAP單克隆抗體(英國Abcam)；二抗試劑盒、DAB試劑盒、進(jìn)口羊血清工作液(北京中杉金橋)。Morris水迷宮、開野視頻跟蹤系統(tǒng)(西班牙Panlab)；倒置顯微鏡(日本Olympus)；高效液相色譜儀(美國安捷倫)；組織切片機(jī)(美國Themo)。

1.3動物分組與造模50只SD大鼠分為2部分，其中20只隨機(jī)分為正常對照組和抑郁模型組，另外30只用于制備糖尿病模型。糖尿病模型建立方法為：高脂灌胃14 d后，大鼠一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)38 mg·kg-1，并于STZ注射72 h后測定大鼠空腹血糖值。去除造模過程中的死亡大鼠，選取空腹血糖≥16.70 mmol·L-1的大鼠，并依據(jù)血糖值隨機(jī)分為糖尿病模型組和DD模型組，每組11只。此后，正常對照組和糖尿病模型組大鼠正常飼養(yǎng)，抑郁模型組和DD模型組大鼠則繼續(xù)給予21 d慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激，應(yīng)激方法包括4℃冰水浴、45℃熱水浴、電擊、夾尾、晝夜顛倒、傾籠等，每天隨機(jī)給予1次應(yīng)激，同種應(yīng)激不連續(xù)出現(xiàn)，造模期間大鼠均孤籠飼養(yǎng)。造模結(jié)束后，所有大鼠進(jìn)行行為學(xué)測試，測試完成后，麻醉大鼠，每組一半大鼠剝離前額葉皮質(zhì)于液氮中速凍，另一半經(jīng)多聚甲醛灌注后取腦組織保存于甲醛溶液中固定。

在上述實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DD模型組大鼠前額葉皮質(zhì)區(qū)caspase-3表達(dá)明顯下降，神經(jīng)元凋亡明顯，同時mGluR2/3、ERK表達(dá)也有異常。為確定該作用是否與調(diào)控Glu-mGluR2/3-ERK信號通路有關(guān)，重新選取35只SD大鼠，分為正常對照組、DD模型組，LY341495干預(yù)組(mGluR2/3阻斷劑組)，其中DD模型組和LY341495干預(yù)組造模方法同上，同時，LY341495干預(yù)組從應(yīng)激造模d 1起連續(xù)腹腔注射LY341495(1 mg·kg-1) 21 d。

1.4行為學(xué)檢測

1.4.1曠場實(shí)驗(yàn) 將大鼠放入底面劃分為25個小格的黑色敞箱中，每次從同一角落放入，大鼠適應(yīng)1 min后，記錄4 min內(nèi)的水平運(yùn)動次數(shù)(四爪均在格內(nèi))和垂直站立次數(shù)(兩前爪抬起)。

1.4.2Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)，分別考察動物的學(xué)習(xí)和記憶能力，① 定位航行實(shí)驗(yàn)：于應(yīng)激d 17開始進(jìn)行訓(xùn)練，將大鼠面向池壁放入水中，自由尋找平臺(高出水面2 cm)，若60 s內(nèi)未找到，則牽引其至平臺停留10 s，持續(xù)訓(xùn)練4 d。訓(xùn)練完成后，將大鼠從背對平臺方向放入水中，記錄大鼠爬上平臺所用時間，即為大鼠的逃避潛伏期時間(latency time)；② 空間探索實(shí)驗(yàn)：于應(yīng)激d 21撤去平臺，記錄大鼠60 s內(nèi)在原平臺所在象限停留時間，即為大鼠的目標(biāo)象限記憶時間(memory time)。

1.5HE染色取固定于甲醛溶液中的腦組織，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋， 以5 μm厚連續(xù)切片。浸泡在0.01 mol·L-1PBS緩沖液中12 h，經(jīng)蘇木精-伊紅染色后脫水，并用中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照，分析各組大鼠前額葉皮質(zhì)區(qū)損傷情況。

1.6HPLC法檢測谷氨酸含量取冷凍保存的前額葉皮質(zhì)，稱重，加入一定量甲醇后勻漿，離心后取上清液，0.22 μm濾膜過濾后待測。HPLC檢測條件為：色譜柱：氨基酸分析柱(250 mm×4 mm，5 μm)；流動相：含5%甲醇乙酸鈉-乙腈(80 ∶ 20)；流速：0.2 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：40℃。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法為：配成1 g·L-1的谷氨酸儲備液，依次稀釋成3.13、0.781、0.195、0.048 8、0.012 2 mg·L-1，根據(jù)各峰面積計算標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=75.09x+34.63，相關(guān)系數(shù)為0.997 8，相關(guān)性良好。

1.7免疫組化法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)取固定于甲醛溶液中的腦組織，常規(guī)石蠟包埋后切片，分別用75%、95%、100%梯度乙醇脫水，浸蠟，水化，沖洗，滴加山羊血清封閉液，37℃孵育30 min，去除血清，加caspase-3、mGluR2/3、ERK一抗4℃孵育過夜；PBS洗3次，滴加二抗試劑盒，反應(yīng)增強(qiáng)液孵10 min，二抗孵10 min；沖洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，封片。將免疫組化切片在高倍鏡下(×400)進(jìn)行拍攝，并采用Image-Pro Plus軟件分析積分光密度值(integral optical density, IOD)。

2 結(jié)果

2.1行為學(xué)檢測

2.1.1Morris水迷宮測試結(jié)果 Tab 1結(jié)果顯示，與對照組比較，各模型組大鼠潛伏期時間均有不同程度的延長，目標(biāo)象限記憶時間縮短(P<0.05或P<0.01)，學(xué)習(xí)記憶功能均受到損害；與糖尿病組比較，抑郁癥和DD組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力也有明顯的下降(P<0.05或P<0.01)。

Tab 1 Comparison of learning and

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsdiabetes model

2.1.2曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Tab 2結(jié)果顯示，與對照組比較，各模型組大鼠水平和垂直運(yùn)動次數(shù)均明顯下降(P<0.05或P<0.01)；與糖尿病組比較，抑郁組和DD組大鼠自主活動次數(shù)明顯下降(P<0.05或P<0.01)；與抑郁組比較，DD模型組大鼠自主活動能力也明顯下降(P<0.05)。

Fig 1 Results of HE staining in rat prefrontal cortex(×400)

Tab 2 Comparison of autonomous

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsdiabetes model;△P<0.05vsdepression model

2.2HE染色結(jié)果如Fig 1所示，正常大鼠前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則，排列整齊，染色質(zhì)均勻，神經(jīng)元間隙正常；各模型組大鼠前額葉皮層神經(jīng)元有不同程度的胞體腫脹，核固縮，胞質(zhì)濃縮深染，排列紊亂，間隙增寬等病理現(xiàn)象，以DD組最為嚴(yán)重。

2.3大鼠前額葉皮層谷氨酸含量如Fig 2所示，與對照組比較，糖尿病組大鼠前額葉皮質(zhì)谷氨酸含量無明顯變化，抑郁癥組和DD組有明顯升高(P<0.01或P<0.05)；與糖尿病模型組比較，抑郁癥組和DD組大鼠谷氨酸含量明顯升高(P<0.05)；與抑郁癥組比較，DD組大鼠谷氨酸含量明顯升高(P<0.05)。

Fig 2 Glutamate content in rat prefrontal

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsdiabetes model;#P<0.05vsdepression model

2.4Caspase-3免疫組化結(jié)果如Fig 3所示，與對照組比較，各模型組大鼠前額葉皮質(zhì)區(qū)caspase-3免疫陽性均明顯增強(qiáng)(P<0.01或P<0.05)，其中以DD組陽性表達(dá)最為明顯，且與糖尿病組和抑郁癥組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。

2.5mGluR2/3和ERK的免疫組化結(jié)果如Fig 4所示，與對照組比較，各模型組大鼠前額葉皮質(zhì)區(qū)mGluR2/3表達(dá)明顯上升，ERK明顯下降，以DD組趨勢最為明顯；與糖尿病組或抑郁癥組比較，DD組大鼠前額葉皮質(zhì)區(qū)mGluR2/3和ERK表達(dá)差異也有顯著性(P<0.01或P<0.05)。

2.6mGluR2/3阻斷劑對前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的影響如Fig 5所示，給予mGluR2/3阻斷劑LY341495后，DD大鼠前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元排列基本整齊、間隙正常，病理損傷情況得到一定緩解，caspase-3免疫陽性表達(dá)明顯下降(P<0.01)，但較正常對照組表達(dá)仍有一定增加(P<0.05)；谷氨酸含量較DD組有一定程度的上升(P<0.05)，可能是由于谷氨酸受體表達(dá)受抑制而致使谷氨酸堆積，mGluR2/3表達(dá)明顯下降(P<0.01)，ERK表達(dá)上升(P<0.05)。說明mGluR2/3-ERK信號在前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡過程中確實(shí)起到調(diào)控作用。

3 討論

抑郁癥是糖尿病常見的并發(fā)癥之一，我國約有51%的糖尿病患者存在不同程度的抑郁癥。糖尿病可與抑郁癥相互加重，增加患者的病死率和致殘率，DD患者自殺率高達(dá)10%[5]。前額葉皮質(zhì)與感覺認(rèn)知、情緒調(diào)節(jié)密切相關(guān)[6]，糖尿病患者容易出現(xiàn)認(rèn)知功能下降，主要表現(xiàn)為前額葉皮質(zhì)功能受損[7]。前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元功能的缺失及神經(jīng)膠質(zhì)性增生則會導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生[8]。

Morris水迷宮被廣泛用于研究與空間學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的腦區(qū)功能評價，曠場實(shí)驗(yàn)是通過觀察大鼠的自發(fā)性探索活性評價大鼠的活動能力，兩者均是動物抑郁樣行為評價的重要方法。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能明顯下降，自主活動能力降低，較糖尿病組和抑郁組均更為嚴(yán)重。Caspase-3是細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段的關(guān)鍵蛋白，負(fù)責(zé)對部分或全部關(guān)鍵蛋白進(jìn)行酶切，使DNA片段化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9]。本研究中，DD大鼠前額葉皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元缺失明顯，并伴有胞體腫脹、核固縮、空泡變性等病理現(xiàn)象，同時caspase-3陽性表達(dá)明顯增多，表明DD大鼠前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元病理改變與凋亡有關(guān)。

Fig3Caspase-3immunohistochemicalstaining
inprefrontalcortexofrats(×400)

Fig4mGluR2/3andERKimmunohistochemicalstaininginprefrontalcortexofrats(×400)

Fig 5 Effects of mGluR2/3 blocker (LY341495) on apoptosis of prefrontal cortical neurons(×400)

谷氨酸是一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常功能活動與神經(jīng)調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要作用，但高濃度谷氨酸具有神經(jīng)毒性作用，能損害神經(jīng)元而誘發(fā)神經(jīng)精神性疾病[10]。糖尿病狀態(tài)下，谷氨酸含量異常升高，與胞內(nèi)mGluR2/3過度結(jié)合，繼而激活下游ERK信號，活化的ERK進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，一方面磷酸化轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)控基因的表達(dá)，影響細(xì)胞周期，進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程[11]；另一方面，通過調(diào)控相關(guān)信號，促使神經(jīng)營養(yǎng)因子合成及分泌下降，神經(jīng)元營養(yǎng)缺失而逐漸凋亡[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DD大鼠前額葉皮質(zhì)區(qū)谷氨酸含量明顯升高，mGluR2/3免疫陽性增強(qiáng)，ERK免疫陽性明顯減弱，說明Glu-mGluR2/3-ERK通路可能在介導(dǎo)前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡過程中發(fā)揮了重要作用。

LY341495是mGluR2/3的特異性拮抗劑[13]。本實(shí)驗(yàn)通過使用LY341495進(jìn)一步證實(shí)Glu-mGluR2/3-ERK通路在DD前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡中的關(guān)鍵作用，結(jié)果表明，給予LY341495后，DD大鼠谷氨酸含量升高，mGluR2/3陽性表達(dá)下降，說明阻斷劑發(fā)揮作用，mGluR2/3表達(dá)受阻，而谷氨酸由于其受體表達(dá)抑制而致其在腦區(qū)堆積，ERK陽性表達(dá)較模型組有明顯變化，說明其受到上游mGluR2/3表達(dá)的影響。同時，DD大鼠前額葉皮質(zhì)損傷情況得到一定程度的緩解，凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3免疫陽性表達(dá)明顯下降，說明LY341495能使DD大鼠前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡減少，并改善其病理損傷。上述結(jié)果說明，DD疾病下，Glu-mGluR2/3-ERK信號通路調(diào)控caspase-3表達(dá)，介導(dǎo)前額葉皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元凋亡，而mGluR2/3阻斷劑能逆轉(zhuǎn)這一過程。

綜上，我們認(rèn)為前額葉皮質(zhì)谷氨酸含量異常增加，Glu-mGluR2/3-ERK信號障礙，導(dǎo)致caspase-3表達(dá)上升，神經(jīng)元發(fā)生凋亡，是導(dǎo)致DD發(fā)生的重要原因。本研究對于以前額葉皮質(zhì)為靶區(qū)的DD發(fā)病機(jī)制研究具有重要意義，下一步將繼續(xù)研究DD下大腦前額葉皮質(zhì)Glu-mGluR2/3-ERK通路與神經(jīng)血管單元損傷間的關(guān)系。

(致謝: 本實(shí)驗(yàn)主要在湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥粉體與創(chuàng)新藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地完成，在此對實(shí)驗(yàn)室各位老師及同學(xué)的幫助表示衷心的感謝!)