胡倩 周瓊 李軍* 李思源 胡穎 李佳佳

1.新疆石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院內分泌代謝科，新疆 石河子 832000 2.新疆第二師二十九團醫(yī)院，新疆 庫爾勒 841000 3.新疆石河子大學醫(yī)學院，新疆 石河子 832000 4.新疆醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000

糖尿病是一種易合并多種并發(fā)癥的慢性代謝性疾病，且2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的發(fā)病人數(shù)約占全部糖尿病患者的90%以上。骨質疏松是T2DM的常見并發(fā)癥，絕經(jīng)是糖尿病和骨質疏松癥的已知危險因素，絕經(jīng)后女性T2DM患者較一般人群更易合并骨量異常，甚至骨質疏松(osteoporosis, OP)[1]。目前，骨質疏松癥(OP)和2型糖尿病(T2DM)被認為是兩個主要的健康問題，兩種疾病在老年人群中都有越來越高的患病率。

Wnt信號通路為高度保守的信號通路，是調節(jié)成骨細胞活性及生成的重要通路，目前研究較為清楚且被廣為關注的是Wnt/β-catenin信號通路。DKK1是一種分泌性糖蛋白，主要通過與低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(LRP5/ LRP6)受體及Kremen-1/2結合成復合物而阻斷Wnt信號傳導，是Wnt經(jīng)典信號通路的重要抑制劑[2]。許多研究表明阻斷DKK1的功能有利于骨形成和防止系統(tǒng)性骨量丟失[3]。本研究通過測定絕經(jīng)后女性T2DM患者外周血Wnt信號通路中DKK1、β-catenin基因的表達并分析其與骨代謝的關系，從基因水平闡明T2DM合并骨代謝異常的發(fā)病機制，有利于絕經(jīng)后女性骨質疏松的防治。

1 材料和方法

1.1 一般資料

選取2015年10月至2016年10月石河子地區(qū)社區(qū)及于我院就診的絕經(jīng)后女性為研究對象，根據(jù)OGTT試驗結果，分為T2DM組、NGT組，每組50人。該實驗已通過石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準，納入對象均簽署知情同意書。

1.2 診斷標準

T2DM的診斷符合1999年WHO制定的糖尿病診斷準則，OP的診斷符合1994年WHO骨質疏松診斷標準。同時排除1型糖尿病、特殊類型糖尿病、自身免疫性疾??；影響骨代謝的各種因素；雌激素、降鈣素、維生素K等影響骨代謝的藥物服用史及其他先天性骨質疏松癥。

1.3 方法

1.3.1常規(guī)指標的測定：由經(jīng)過專業(yè)培訓的工作人員按統(tǒng)一標準對受試者進行常規(guī)指標的測量，包括年齡(age)、身高(height)、體重(weight)，并計算體質指數(shù)(BMI)=體重(kg)/身高2(m2)。

1.3.2一般生化指標的測定：全自動生化分析儀(7071型，日本日立株式會社)測定空腹血糖(FPG)、果糖胺(FMN)、鈣(Ca)、磷(P)等生化指標。

1.3.3骨密度的測定：雙能X線骨密度檢測儀(法國MEDI LINK公司)測定腰椎及股骨骨密度。

1.3.4DKK1, β-catenin基因的測定：實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad CFX96 Manager? Thermo公司) 測定DKK1, β-catenin基因的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 兩組間一般資料的比較

對絕經(jīng)后女性NGT組和T2DM組年齡以及體質指數(shù)(BMI)進行統(tǒng)計分析，組間均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，說明資料齊，具有可比性(見圖1)。

圖1 T2DM組與NGT組年齡及BMI比較情況Fig.1 Comparison of age and BMI between T2DM group and NGT group

2.2 兩組間生化指標的比較

與絕經(jīng)后女性NGT組相比，T2DM組糖代謝指標：FPG、FMN、HbA1c水平較高(P<0.01)；骨代謝指標：P水平較高(P<0.01)。見表1。

指標 NGT組 T2DM組P值FPG/(mmol/L)5.47±0.739.26±2.38**<0.001FMN/(μmol/L)239.74±36.54337.66±87.31**<0.001HbA1c/%6.23±0.928.70±1.76**<0.001Ca/(mmol/L)2.26±0.082.28±0.080.277P/(mmol/L)1.11±0.121.24±0.16**<0.001ALP/(U/L)76.85±18.0573.68±24.330.541

注：與NGT組比較，**P<0.01。

2.3 兩組間骨密度情況的比較

T2DM組股骨(femur)BMD較NGT組顯著降低(P<0.05)，余部位無統(tǒng)計學差異。見表2。

表2NGT組與T2DM組不同部位骨密度比較(g/cm2)

Table2Comparison of bone mineral density in different parts between NGT group and T2DM group(g/cm2)

指標 NGT組 T2DM組P值L10.93(0.81, 1.02)0.91(0.81, 1.00)0.673L20.99(0.87, 1.12)0.92(0.86, 1.10)0.165L31.061(0.93, 1.15)1.00(0.90, 1.16)0.258L41.10(0.95, 1.24)1.03(0.90, 1.23)0.432L1-L41.00(0.88, 1.12)0.99(0.87, 1.10)0.448Femoral neck0.99(0.78, 1.23)1.02(0.92, 1.11)0.553Femur0.87(0.80, 0.95)0.80(0.61, 0.90)**0.003

注：與NGT組比較，**P<0.01。

2.4 兩組間DKK1基因表達水平的比較

與絕經(jīng)后女性NGT組相比，T2DM組DKK1基因表達水平較高，外周血白細胞qRT-PCR數(shù)據(jù)經(jīng)2-△△Ct計算：(1, 5.99)，T2DM組DKK1基因表達水平為NGT組的5.99倍(P<0.05)見圖2。

圖2 T2DM組與NGT組白細胞內DKK1表達情況Fig.2 Dkk1 expression in white blood cells in T2DM and NGT groups

2.5 兩組間β-catenin基因表達水平比較

與絕經(jīng)后女性NGT組相比，T2DM組β-catenin基因表達水平顯著降低，外周血白細胞qRT-PCR數(shù)據(jù)經(jīng)2-△△Ct計算：(1, 0.46)，T2DM組β-catenin基因表達水平為NGT組的0.46倍，見圖3。

圖3 T2DM組與NGT組白細胞內β-catenin表達情況Fig.3 Expression of β-catenin in white blood cells of T2DM and NGT groups

2.6 T2DM組中β-catenin基因與骨代謝指標相關性分析

分析絕經(jīng)后女性2型糖尿病患者β-catenin基因與骨代謝指標相關性，分析結果顯示，在絕經(jīng)后女性T2DM組中，β-catenin基因與P呈負相關關系，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表3。

表3β-catenin基因與骨代謝指標相關性分析

Table3Correlation analysis between β-catenin gene and bone metabolism indexes

指標CaPALPβ-cateninr -0.146-0.287*0.123geneP 0.3110.0430.396

注：*P<0.05。

2.7 以骨代謝指標為應變量進行多元線性回歸分析

以骨代謝指標(Ca，P，ALP)為應變量，以DKK1基因和β-catenin基因為自變量，進行多元線性逐步回歸分析，在T2DM組中，β-catenin基因進入以P為應變量的回歸方程，其他指標未進入回歸方程。而在NGT組中，所有指標均未進入回歸方程。由表4可建立以P為應變量的回歸方程：Y=1.445-0.287X。

表4以骨代謝指標為應變量的多元線性回歸分析

Table4Multivariate linear regression analysis with bone metabolic indexes as dependent variables

變量B標準化系數(shù)t值P值常量1.44514.165<0.001β-catenin gene-0.010-0.287-2.0780.043

3 討論

眾多研究均表明糖尿病患者易合并骨代謝異常[4]。糖尿病患者由于血糖的升高會抑制胰島素樣生長因子(IGF-I)的生成，從而減弱其成骨作用；胰島素分泌不足或缺乏會影響成骨細胞的骨形成和破骨細胞的骨吸收，進而對骨質疏松的發(fā)生發(fā)展產生影響[5- 6]。絕經(jīng)后女性由于卵巢功能的衰退，雌激素產生及分泌減少，激素水平的異常影響骨代謝，使成骨細胞生成減少，而破骨細胞生成增多，骨的吸收大于骨的形成作用，因此絕經(jīng)后女性更易發(fā)生骨折疏松[7]。然而，目前絕經(jīng)后女性2型糖尿病患者骨質疏松的發(fā)病機制尚不明確。

研究表明，Wnt/β-catenin經(jīng)典信號通路在成骨細胞分化和功能上起著關鍵作用, Wnt信號通路激活不僅通過刺激成骨細胞的發(fā)生進而增加骨量，同時也抑制著破骨細胞的發(fā)生[8]。DKK1作為DKK家族中最好的特征成員之一，是經(jīng)典Wnt /β-catenin信號通路的強有力的抑制劑。Ahmed等[9]的研究結果顯示血清DKK1明顯升高的絕經(jīng)后婦女有更嚴重的骨質疏松，表明較高水平的DKK1可能是骨質疏松發(fā)生和嚴重程度的生物標志物。相關研究[10-11]表明，外周血Wnt通路中DKK1、β-catenin表達水平對骨組織Wnt及骨代謝有重要影響，這與本研究結果相符。

Corrado等[12]的研究結果表明，與健康人群相比，骨質疏松患者DKK1表達水平增高，β-catenin表達水平降低，DKK1的高表達抑制了β-catenin信號，使軟骨生成和骨生成減少。研究發(fā)現(xiàn)在T2DM患者體內，膠原組織中骨膠原代謝增高，導致骨吸收增強，血P水平較正常人群升高。在本研究中，DKK1基因表達水平在T2DM組升高，而β-catenin基因表達水平在T2DM組降低，同時P在T2DM組中表達升高，且股骨骨密度降低，P與β-catenin基因表達(r=-0.287；P=0.043)呈負相關關系，提示絕經(jīng)后女性T2DM患者體內，血P水平隨β-catenin基因表達水平降低而增高，可進一步說明絕經(jīng)后女性T2DM患者Wnt信號通路表達異常，DKK1基因的高表達可能抑制了其下游通路的轉導，從而導致β-catenin基因的低表達，進而通過對血P水平的影響參與骨代謝異常。該研究結果為絕經(jīng)后女性T2DM患者骨質疏松的發(fā)病機制提供線索，并且為該人群骨質疏松的預防及治療提供依據(jù)。