胡倩 周瓊 李軍* 李思源 胡穎 李佳佳
1.新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科,新疆 石河子 832000 2.新疆第二師二十九團(tuán)醫(yī)院,新疆 庫(kù)爾勒 841000 3.新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院,新疆 石河子 832000 4.新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830000
糖尿病是一種易合并多種并發(fā)癥的慢性代謝性疾病,且2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)的發(fā)病人數(shù)約占全部糖尿病患者的90%以上。骨質(zhì)疏松是T2DM的常見并發(fā)癥,絕經(jīng)是糖尿病和骨質(zhì)疏松癥的已知危險(xiǎn)因素,絕經(jīng)后女性T2DM患者較一般人群更易合并骨量異常,甚至骨質(zhì)疏松(osteoporosis, OP)[1]。目前,骨質(zhì)疏松癥(OP)和2型糖尿病(T2DM)被認(rèn)為是兩個(gè)主要的健康問(wèn)題,兩種疾病在老年人群中都有越來(lái)越高的患病率。
Wnt信號(hào)通路為高度保守的信號(hào)通路,是調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞活性及生成的重要通路,目前研究較為清楚且被廣為關(guān)注的是Wnt/β-catenin信號(hào)通路。DKK1是一種分泌性糖蛋白,主要通過(guò)與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(LRP5/ LRP6)受體及Kremen-1/2結(jié)合成復(fù)合物而阻斷Wnt信號(hào)傳導(dǎo),是Wnt經(jīng)典信號(hào)通路的重要抑制劑[2]。許多研究表明阻斷DKK1的功能有利于骨形成和防止系統(tǒng)性骨量丟失[3]。本研究通過(guò)測(cè)定絕經(jīng)后女性T2DM患者外周血Wnt信號(hào)通路中DKK1、β-catenin基因的表達(dá)并分析其與骨代謝的關(guān)系,從基因水平闡明T2DM合并骨代謝異常的發(fā)病機(jī)制,有利于絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松的防治。
選取2015年10月至2016年10月石河子地區(qū)社區(qū)及于我院就診的絕經(jīng)后女性為研究對(duì)象,根據(jù)OGTT試驗(yàn)結(jié)果,分為T2DM組、NGT組,每組50人。該實(shí)驗(yàn)已通過(guò)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),納入對(duì)象均簽署知情同意書。
T2DM的診斷符合1999年WHO制定的糖尿病診斷準(zhǔn)則,OP的診斷符合1994年WHO骨質(zhì)疏松診斷標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)排除1型糖尿病、特殊類型糖尿病、自身免疫性疾??;影響骨代謝的各種因素;雌激素、降鈣素、維生素K等影響骨代謝的藥物服用史及其他先天性骨質(zhì)疏松癥。
1.3.1常規(guī)指標(biāo)的測(cè)定:由經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)的工作人員按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)對(duì)受試者進(jìn)行常規(guī)指標(biāo)的測(cè)量,包括年齡(age)、身高(height)、體重(weight),并計(jì)算體質(zhì)指數(shù)(BMI)=體重(kg)/身高2(m2)。
1.3.2一般生化指標(biāo)的測(cè)定:全自動(dòng)生化分析儀(7071型,日本日立株式會(huì)社)測(cè)定空腹血糖(FPG)、果糖胺(FMN)、鈣(Ca)、磷(P)等生化指標(biāo)。
1.3.3骨密度的測(cè)定:雙能X線骨密度檢測(cè)儀(法國(guó)MEDI LINK公司)測(cè)定腰椎及股骨骨密度。
1.3.4DKK1, β-catenin基因的測(cè)定:實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad CFX96 Manager? Thermo公司) 測(cè)定DKK1, β-catenin基因的表達(dá)水平。
對(duì)絕經(jīng)后女性NGT組和T2DM組年齡以及體質(zhì)指數(shù)(BMI)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),說(shuō)明資料齊,具有可比性(見圖1)。
圖1 T2DM組與NGT組年齡及BMI比較情況Fig.1 Comparison of age and BMI between T2DM group and NGT group
與絕經(jīng)后女性NGT組相比,T2DM組糖代謝指標(biāo):FPG、FMN、HbA1c水平較高(P<0.01);骨代謝指標(biāo):P水平較高(P<0.01)。見表1。
指標(biāo) NGT組 T2DM組P值FPG/(mmol/L)5.47±0.739.26±2.38**<0.001FMN/(μmol/L)239.74±36.54337.66±87.31**<0.001HbA1c/%6.23±0.928.70±1.76**<0.001Ca/(mmol/L)2.26±0.082.28±0.080.277P/(mmol/L)1.11±0.121.24±0.16**<0.001ALP/(U/L)76.85±18.0573.68±24.330.541
注:與NGT組比較,**P<0.01。
T2DM組股骨(femur)BMD較NGT組顯著降低(P<0.05),余部位無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表2。
表2NGT組與T2DM組不同部位骨密度比較(g/cm2)
Table2Comparison of bone mineral density in different parts between NGT group and T2DM group(g/cm2)
指標(biāo) NGT組 T2DM組P值L10.93(0.81, 1.02)0.91(0.81, 1.00)0.673L20.99(0.87, 1.12)0.92(0.86, 1.10)0.165L31.061(0.93, 1.15)1.00(0.90, 1.16)0.258L41.10(0.95, 1.24)1.03(0.90, 1.23)0.432L1-L41.00(0.88, 1.12)0.99(0.87, 1.10)0.448Femoral neck0.99(0.78, 1.23)1.02(0.92, 1.11)0.553Femur0.87(0.80, 0.95)0.80(0.61, 0.90)**0.003
注:與NGT組比較,**P<0.01。
與絕經(jīng)后女性NGT組相比,T2DM組DKK1基因表達(dá)水平較高,外周血白細(xì)胞qRT-PCR數(shù)據(jù)經(jīng)2-△△Ct計(jì)算:(1, 5.99),T2DM組DKK1基因表達(dá)水平為NGT組的5.99倍(P<0.05)見圖2。
圖2 T2DM組與NGT組白細(xì)胞內(nèi)DKK1表達(dá)情況Fig.2 Dkk1 expression in white blood cells in T2DM and NGT groups
與絕經(jīng)后女性NGT組相比,T2DM組β-catenin基因表達(dá)水平顯著降低,外周血白細(xì)胞qRT-PCR數(shù)據(jù)經(jīng)2-△△Ct計(jì)算:(1, 0.46),T2DM組β-catenin基因表達(dá)水平為NGT組的0.46倍,見圖3。
圖3 T2DM組與NGT組白細(xì)胞內(nèi)β-catenin表達(dá)情況Fig.3 Expression of β-catenin in white blood cells of T2DM and NGT groups
分析絕經(jīng)后女性2型糖尿病患者β-catenin基因與骨代謝指標(biāo)相關(guān)性,分析結(jié)果顯示,在絕經(jīng)后女性T2DM組中,β-catenin基因與P呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表3。
表3β-catenin基因與骨代謝指標(biāo)相關(guān)性分析
Table3Correlation analysis between β-catenin gene and bone metabolism indexes
指標(biāo)CaPALPβ-cateninr -0.146-0.287*0.123geneP 0.3110.0430.396
注:*P<0.05。
以骨代謝指標(biāo)(Ca,P,ALP)為應(yīng)變量,以DKK1基因和β-catenin基因?yàn)樽宰兞?,進(jìn)行多元線性逐步回歸分析,在T2DM組中,β-catenin基因進(jìn)入以P為應(yīng)變量的回歸方程,其他指標(biāo)未進(jìn)入回歸方程。而在NGT組中,所有指標(biāo)均未進(jìn)入回歸方程。由表4可建立以P為應(yīng)變量的回歸方程:Y=1.445-0.287X。
表4以骨代謝指標(biāo)為應(yīng)變量的多元線性回歸分析
Table4Multivariate linear regression analysis with bone metabolic indexes as dependent variables
變量B標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)t值P值常量1.44514.165<0.001β-catenin gene-0.010-0.287-2.0780.043
眾多研究均表明糖尿病患者易合并骨代謝異常[4]。糖尿病患者由于血糖的升高會(huì)抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-I)的生成,從而減弱其成骨作用;胰島素分泌不足或缺乏會(huì)影響成骨細(xì)胞的骨形成和破骨細(xì)胞的骨吸收,進(jìn)而對(duì)骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響[5- 6]。絕經(jīng)后女性由于卵巢功能的衰退,雌激素產(chǎn)生及分泌減少,激素水平的異常影響骨代謝,使成骨細(xì)胞生成減少,而破骨細(xì)胞生成增多,骨的吸收大于骨的形成作用,因此絕經(jīng)后女性更易發(fā)生骨折疏松[7]。然而,目前絕經(jīng)后女性2型糖尿病患者骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制尚不明確。
研究表明,Wnt/β-catenin經(jīng)典信號(hào)通路在成骨細(xì)胞分化和功能上起著關(guān)鍵作用, Wnt信號(hào)通路激活不僅通過(guò)刺激成骨細(xì)胞的發(fā)生進(jìn)而增加骨量,同時(shí)也抑制著破骨細(xì)胞的發(fā)生[8]。DKK1作為DKK家族中最好的特征成員之一,是經(jīng)典Wnt /β-catenin信號(hào)通路的強(qiáng)有力的抑制劑。Ahmed等[9]的研究結(jié)果顯示血清DKK1明顯升高的絕經(jīng)后婦女有更嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松,表明較高水平的DKK1可能是骨質(zhì)疏松發(fā)生和嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物。相關(guān)研究[10-11]表明,外周血Wnt通路中DKK1、β-catenin表達(dá)水平對(duì)骨組織Wnt及骨代謝有重要影響,這與本研究結(jié)果相符。
Corrado等[12]的研究結(jié)果表明,與健康人群相比,骨質(zhì)疏松患者DKK1表達(dá)水平增高,β-catenin表達(dá)水平降低,DKK1的高表達(dá)抑制了β-catenin信號(hào),使軟骨生成和骨生成減少。研究發(fā)現(xiàn)在T2DM患者體內(nèi),膠原組織中骨膠原代謝增高,導(dǎo)致骨吸收增強(qiáng),血P水平較正常人群升高。在本研究中,DKK1基因表達(dá)水平在T2DM組升高,而β-catenin基因表達(dá)水平在T2DM組降低,同時(shí)P在T2DM組中表達(dá)升高,且股骨骨密度降低,P與β-catenin基因表達(dá)(r=-0.287;P=0.043)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,提示絕經(jīng)后女性T2DM患者體內(nèi),血P水平隨β-catenin基因表達(dá)水平降低而增高,可進(jìn)一步說(shuō)明絕經(jīng)后女性T2DM患者Wnt信號(hào)通路表達(dá)異常,DKK1基因的高表達(dá)可能抑制了其下游通路的轉(zhuǎn)導(dǎo),從而導(dǎo)致β-catenin基因的低表達(dá),進(jìn)而通過(guò)對(duì)血P水平的影響參與骨代謝異常。該研究結(jié)果為絕經(jīng)后女性T2DM患者骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制提供線索,并且為該人群骨質(zhì)疏松的預(yù)防及治療提供依據(jù)。