王麗隨 范哲華 陳海英*

1. 福建莆田市第一醫(yī)院藥劑科，福建 莆田 351100 2. 福建莆田學(xué)院，福建 莆田 351100

骨質(zhì)疏松癥是一種中老年人常見(jiàn)的骨量低、骨組織微結(jié)構(gòu)損壞的骨骼疾病，絕經(jīng)后女性發(fā)病率明顯高于男性[1]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥目前常用的雌激素替代療法(HRT)會(huì)增加子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌的發(fā)生率。雷洛昔芬屬于選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)，對(duì)骨組織有雌激素樣功效，保持骨量和增加骨礦鹽密度，但對(duì)子宮、乳腺有抗雌激素功效[2]，可替代雌激素防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。仙靈骨葆含淫羊藿、續(xù)斷等中藥成分，能增加骨密度、促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收、促進(jìn)骨重建，且不刺激子宮[3]。目前關(guān)于雷洛昔芬和仙靈骨葆對(duì)大鼠骨質(zhì)疏松骨微結(jié)構(gòu)和骨生物力學(xué)性能影響的研究較少，本研究選取雷洛昔芬和仙靈骨葆作為干預(yù)因素，通過(guò)觀察骨質(zhì)疏松大鼠骨微結(jié)構(gòu)及大鼠骨生物力學(xué)性能的改變情況，探討雷洛昔芬和仙靈骨葆調(diào)控骨吸收與骨形成及其防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 大鼠骨質(zhì)疏松模型的建立

選用清潔級(jí)6月齡SD雌性大鼠40只，體重200～220 g，由福州吳氏動(dòng)物中心提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，摘除大鼠雙側(cè)卵巢，飼養(yǎng)3個(gè)月建立標(biāo)準(zhǔn)骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型。隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、干預(yù)1組，干預(yù)2組，每組8只。干預(yù)1組大鼠給于雷洛昔芬(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)6.2 mg/(kg·d)溶于2 mL注射用水形成溶液后經(jīng)口灌胃，干預(yù)2組大鼠給于雷洛昔芬(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)6.2 mg/(kg·d)聯(lián)合仙靈骨葆(貴州同濟(jì)堂制藥有限公司)250 mg/(kg·d)溶于2 mL注射用水形成溶液后經(jīng)口灌胃，正常組、假手術(shù)組、模型組給于經(jīng)口灌胃注射用水。飼養(yǎng)12周。

1.2 骨標(biāo)本的制備

組織學(xué)觀察及圖象分析：25%的烏拉坦麻醉后取股骨，4%多聚甲醛固定、脫水脫脂、脫鈣、包埋(冠狀面)，酸處理，烘干。切片機(jī)(德國(guó) Leica RM2015)連續(xù)切片(厚度4 μm)。HE染色，光學(xué)顯微鏡(日本Olympus BX51T-PHD-J11)觀察。進(jìn)行200×和400×的顯微照相，編號(hào)、采集存盤。觀察并測(cè)量骨小梁。同樣要求在不同多個(gè)視野各測(cè)定一次，取平均值。

1.3 Van Gieson膠原纖維染色

切片以Van Gieson進(jìn)行膠原纖維染色，光鏡下觀察膠原纖維沉積情況。

1.4 血清蛋白聚糖檢測(cè)

大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血，室溫下離心 10 min，取上清液-80 ℃ 保存。采用比利時(shí) Bisoure 公司生產(chǎn)的蛋白聚糖 ELISA 試劑盒，按說(shuō)明書(shū)操作，蛋白聚糖測(cè)定免疫化學(xué)原理為間接夾心法。

1.5 生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)

股骨三點(diǎn)彎曲力學(xué)試驗(yàn)及股骨生物力學(xué)指標(biāo)測(cè)定：將所有右側(cè)股骨置于 Instron 萬(wàn)能材料力學(xué)測(cè)試裝置上作三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)，中央垂直施加載荷，以1 mm /min 的速度對(duì)股骨緩慢勻速加載直至股骨斷裂。軟件自動(dòng)記錄，數(shù)據(jù)分析換算得出最大載荷(FM)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析測(cè)定和計(jì)量數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。在該實(shí)驗(yàn)中，各組的個(gè)體之間相互獨(dú)立，不存在聯(lián)系，是獨(dú)立樣本。此外，樣本均數(shù)都來(lái)自正態(tài)分布總體，樣本符合正態(tài)分布。因此，采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較組間差異，P<0.01表示差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)包含兩種情況。情況一：當(dāng)兩總體方差相等時(shí)，即方差齊性。按兩獨(dú)立樣本數(shù)據(jù)的均值比較的檢驗(yàn)進(jìn)行分析。情況二：當(dāng)兩總體方差不相等，不滿足方差齊性，即方差不齊。要使用校正的t檢驗(yàn)方法，此時(shí)需要校正t值與自由度值。

2 結(jié)果

2.1 各組骨組織形態(tài)學(xué)比較

正常對(duì)照組和假手術(shù)組股骨骨小梁粗大稍厚，未見(jiàn)吸收或斷裂現(xiàn)象 (圖1 A、圖1B)。模型組骨小梁排列稀疏變薄、骨髓腔變大、間距增大、結(jié)構(gòu)紊亂，部分骨小梁斷裂。可見(jiàn)空缺骨陷窩(圖1C)。干預(yù)1組骨小梁較多較厚，未見(jiàn)骨小梁斷裂，可見(jiàn)少量空缺骨陷窩(圖1D)。干預(yù)2組骨小梁的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)照組組，且骨小梁之間聯(lián)系緊密(圖1E)。

圖1 各組骨組織形態(tài)學(xué)Fig.1 Bone histomorphometry

2.2 骨膜膠原代謝的改變

Van Gieson染色結(jié)果：正常對(duì)照組和假手術(shù)組骨基質(zhì)膠原纖維染色深，緊致有序(圖2 A、圖2B)。模型組骨基質(zhì)膠原纖維松散，染色淺，排列稀疏 (圖2C)。干預(yù)1組骨基質(zhì)膠原纖維積聚、緊密排列，方向有序(圖2D)。干預(yù)2組骨基質(zhì)增厚增寬，膠原纖維積聚(圖2E)。

圖2骨膜膠原代謝的改變Fig.2 The change of collagen metabolism in the bone

2.3 組織計(jì)量學(xué)指標(biāo)測(cè)定統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果

與對(duì)照組相比：假手術(shù)組沒(méi)有出現(xiàn)明顯改變。模型組骨小梁厚度(Tb.Th)明顯下降(均P<0.05)。干預(yù)1組Tb.Th明顯升高(均P<0.05)。干預(yù)2組Tb.Th明顯升高(P<0.05)(圖3)。

圖3各組骨小梁厚度Fig.3 Comparison of Tb.Th

2.4 骨膜膠原面密度積分統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果

與對(duì)照組相比，假手術(shù)組膠原面密度積分沒(méi)有出現(xiàn)明顯改變。模型組膠原面密度積分明顯下降(均P<0.05)。干預(yù)1組膠原面密度積分明顯升高(均P<0.05)。干預(yù)2組膠原面密度積分明顯升高(P<0.05)。

2.5 血清蛋白聚糖測(cè)定

與對(duì)照組相比，假手術(shù)組血清蛋白聚糖含量沒(méi)有出現(xiàn)明顯改變。模型組血清蛋白聚糖活性明顯升高(均P<0.05)。干預(yù)1組血清蛋白聚糖含量明顯下降(均P<0.05)。干預(yù)2組血清蛋白聚糖含量明顯下降(P<0.05)(圖4)。

圖4各組血清蛋白聚糖含量Fig.4 Serum proteoglycan

2.6 各組大鼠右股骨三點(diǎn)彎曲測(cè)試結(jié)果

與對(duì)照組相比，假手術(shù)組右股骨三點(diǎn)彎曲測(cè)試最大載荷(FM)沒(méi)有出現(xiàn)明顯改變。模型組最大載荷(FM)明顯下降(均P<0.05)。干預(yù)1組最大載荷(FM)明顯升高(均P<0.05)。干預(yù)2組最大載荷(FM)明顯升高(P<0.05) (圖5)。

圖5各組生物力學(xué)最大載荷Fig.5 The maximal load (FM) of biomechanical property)

3 討論

機(jī)體的成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞前體及破骨細(xì)胞上都存在雌激素受體，與女性絕經(jīng)后雌激素下降導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥具有相關(guān)性。雷洛昔芬是SERM的第二代非甾體苯并噻吩衍生物，可通過(guò)選擇性地與骨細(xì)胞上的雌激素受體結(jié)合發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)骨的形成、吸收與重建[2]；能增加骨密度，但不增加子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌的發(fā)生率[4]。謝江濤等[5]研究表明雷洛昔芬可減慢骨質(zhì)丟失，顯著改善顯著改善去勢(shì)大鼠骨材料力學(xué)和結(jié)構(gòu)力學(xué)性能，維持較好的骨生物力學(xué)性能，防治骨質(zhì)疏松癥安全可靠。

仙靈骨葆具有植物雌激素樣功能[3]，可改善骨轉(zhuǎn)換，增加骨密度，抑制骨量流失[6]；還可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，優(yōu)化骨小梁結(jié)構(gòu)，改善骨質(zhì)疏松癥狀[7]，不增加子宮肌瘤等疾病的風(fēng)險(xiǎn)[8]。朱太詠等[9]研究表明仙靈骨葆能提高股骨生物力學(xué)應(yīng)答調(diào)節(jié)功能，改善骨力學(xué)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)骨強(qiáng)度，有效預(yù)防骨折。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雷洛昔芬聯(lián)合仙靈骨葆組相比雷洛昔芬組，其防治骨質(zhì)疏松癥更具優(yōu)勢(shì)，更有效地提髙骨質(zhì)疏松動(dòng)物局部骨密度，實(shí)驗(yàn)提示增加骨小梁的數(shù)量、厚度，增加骨股最大載荷，增強(qiáng)骨的生物力學(xué)強(qiáng)度；骨基質(zhì)膠原纖維更積聚有序，膠原面密度積分升高更明顯；血清蛋白聚糖含量下降更明顯。骨小梁體積占全部骨組織體積百分比增加，反映了經(jīng)雷洛昔芬聯(lián)合仙靈骨葆組治療后骨量增加，骨強(qiáng)度增強(qiáng)，骨股最大載荷也增大，有效改善其骨微結(jié)構(gòu)，有效阻止生物力學(xué)性能受損。在骨基質(zhì)礦化、骨質(zhì)的形成與吸收、骨細(xì)胞的增值與分化等過(guò)程中，骨基質(zhì)膠原纖維起著重要的作用，膠原面密度積分升高，在骨骼中相互交錯(cuò)，呈網(wǎng)狀排列，為骨基質(zhì)中無(wú)機(jī)物羥基磷灰石晶體提供沉積位點(diǎn)，對(duì)骨骼系統(tǒng)產(chǎn)生明顯的影響。謝江濤等[5]表示骨膠原纖維結(jié)構(gòu)的改變及其性能下降都會(huì)導(dǎo)致骨生物力學(xué)性能的下降。另鑒于骨組織的生物學(xué)特性，骨生物合成的研究經(jīng)常采用軟骨組織進(jìn)行研究[10]，骨質(zhì)疏松癥與蛋白聚糖關(guān)系密切，蛋白聚糖在維持骨功能中起著非常重要的調(diào)節(jié)和控制作用，其代謝與骨基質(zhì)發(fā)育和退變等有著密切的關(guān)系，可促進(jìn)軟骨鈣化來(lái)防治骨質(zhì)疏松癥[11]。在生理?xiàng)l件下，蛋白聚糖帶負(fù)電荷，可結(jié)合Ca2+、Na+、K+等陽(yáng)離子，能捕捉固定金屬離子、半受體和生長(zhǎng)因子等，并很大程度地影響它們?cè)诨|(zhì)中的分布、傳遞和維持骨的功能及形狀。蛋白聚糖與膠原纖維兩者都決定骨的韌性及其抗壓負(fù)荷的程度等。

雷洛昔芬是選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，可代替雌激素防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，安全可靠。仙靈骨葆可以通過(guò)調(diào)整人體的整體功能，調(diào)節(jié)體內(nèi)多個(gè)系統(tǒng)，治療骨質(zhì)疏松[12]。雷洛昔芬聯(lián)合仙靈骨葆防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，中西結(jié)合，取長(zhǎng)補(bǔ)短，既可增強(qiáng)療效，又可減少不良反應(yīng)，較單獨(dú)使用雷洛昔芬具有更好的防治效果，更安全有效。

本研究具有局限性，我們還需要進(jìn)一步探索骨骼生化性能變化，及其發(fā)生機(jī)制，進(jìn)一步確定最佳治療劑量等等。