陳春野，胡艷艷,2，鄭 彬,2，方青青,2，張敏霞，趙婉意,2，王曉鳳,2，張丁叮,2，談偉強(qiáng),2@

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第四醫(yī)院，浙江 義烏 322000；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院，浙江 杭州 310016)

皮膚衰老是一種持續(xù)漸進(jìn)性的生理過(guò)程，直接影響皮膚的外觀和功能。隨著對(duì)皮膚衰老機(jī)理的深入研究, 人們不斷研究和總結(jié)預(yù)防和延緩皮膚衰老的有效途徑和方法。殼聚糖(chitosan)是甲殼素的脫乙?；a(chǎn)物，也是天然存在的唯一的堿性多糖[1-2]。已有研究表明，殼聚糖可以給皮膚提供膠原蛋白等，還可以刺激加快表皮細(xì)胞的再生速度，以達(dá)到減緩衰老的效果，是優(yōu)異的醫(yī)用敷料及組織工程材料[1-3]。羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)是亞氨基酸之一，是膠原組織的主要成分之一，且為膠原中特有的氨基酸，可用它衡量膠原的量作為定量指標(biāo)檢測(cè)皮膚的衰老程度[4-5]。本研究以自然老化的健康SD大鼠為研究對(duì)象，以大鼠背部皮膚組織勻漿中羥脯氨酸含量為指標(biāo)，以及各組大鼠皮膚組織形態(tài)學(xué)的差異，來(lái)探討殼聚糖在抗皮膚衰老方面的實(shí)際效果。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥物與試劑 殼聚糖，平均分子質(zhì)量M≈106，脫乙酰度85%，浙江金殼藥業(yè)有限公司(殼聚糖護(hù)膚液由本課題組研制[6]，其主要是將不同分子量的殼聚糖混合后溶于1%稀醋酸中，使殼聚糖的最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%)；維生素E注射液(上海通用藥業(yè)股份有限公司)；0.9%NaCl溶液；羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)科學(xué)院上海生化研究所，層析純)，用0.01N HCl配置，1ml相當(dāng)于500μg；羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液：1ml相當(dāng)于10μg；8%硫化鈉酒精溶液；檸檬酸緩沖液(PH 5～7)；氯胺-T液(0.05mol/L)；過(guò)氯酸液(3.15mol/L)；對(duì)-二甲氨基苯甲醛液(8% g/g)；6N HCl；10N NaOH；表皮分離液(EDTA法)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠，重量為180g-200g，雄性，受試部位皮膚無(wú)異常。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 皮膚標(biāo)本及皮膚消化液的制備 取6只大鼠，分籠飼養(yǎng)，自由飲水。大鼠背部用8%硫化鈉酒精溶液脫毛后，用溫和清潔劑洗凈，在大鼠背部畫(huà)6個(gè)1.5cm×1.5cm方格，做上標(biāo)記。在相應(yīng)方格內(nèi)(每組藥物隨機(jī)在每只大鼠上涂抹2個(gè)方格，一份用于羥脯氨酸測(cè)定，一份用于組織形態(tài)學(xué)觀察)，分別用滴管定量滴殼聚糖(實(shí)驗(yàn)組)、維生素E(陽(yáng)性對(duì)照組)、生理鹽水(陰性對(duì)照組)并涂抹均勻。每天涂抹一次，連續(xù)涂藥30天。第31天，選取每只大鼠背部涂抹處皮膚，取得的新鮮皮膚刮去疏松結(jié)締組織及脂肪，用表皮分離液剝?nèi)ケ砥?，留取真皮層，用吸水紙印壓組織塊，至無(wú)水分在吸水紙上出現(xiàn)為止。如暫時(shí)不做，可放入-4℃冷凍室保存，速凍標(biāo)本不影響測(cè)定結(jié)果。將組織剪碎混合，稱取5mg皮膚標(biāo)本，放入5ml具塞刻度試管中，加入6N HCl 2ml，至烤箱(125℃)加熱2h水解，加入10N NaOH 1ml(調(diào)PH5～7)加水至5ml，制成皮膚消化液。每組均產(chǎn)生6份大鼠的皮膚消化液樣本用于測(cè)定羥脯氨酸含量，共18份，測(cè)定羥脯氨酸含量的方法采用紫外分光光度法[7]。

1.2.2 標(biāo)本吸光度測(cè)定 分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8及1.0ml羥脯氨酸溶液于5ml刻度試管中，在562nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度分別測(cè)定其分光度。以羥脯氨酸含量(ng)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取皮膚消化液0.1ml至測(cè)定管中加水至1ml；標(biāo)準(zhǔn)管取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5ml加水至1ml；空白加水1ml。各管加入檸檬酸緩沖液1ml和氯胺-T 1ml，混勻后放置6min，再加入過(guò)氯酸混勻，放置5min，最后加入對(duì)-二甲氨基苯甲醛液1ml，放置75℃水浴10min，取出后迅速冷卻至室溫。在562nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出每個(gè)處理組的羥脯氨酸含量。

1.2.3 殼聚糖對(duì)大鼠皮膚組織形態(tài)學(xué)的影響 將1.2.1制備標(biāo)本中另一份各組受試皮膚，分別用20%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠皮膚組織形態(tài)學(xué)差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本文所有數(shù)據(jù)均錄入EXCEL 2016及SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.2.2的方法，測(cè)定羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定不同濃度羥脯氨酸測(cè)定的吸光度，以羥脯氨酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，并計(jì)算出回歸方程為：y=0.000005x-0.0027，羥脯氨酸濃度與吸光度之間的線性相關(guān)系數(shù)r=0.9601(P=0.006)，確定R2=0.9218 (P<0.01)，表明羥脯氨酸濃度與吸光度之間良好的線性相關(guān)關(guān)系。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 每組大鼠皮膚中羥脯氨酸含量的計(jì)算及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將1.2.1中制備的皮膚消化液18份均做吸光度檢測(cè)，代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計(jì)算出每份消化液樣本的羥脯氨酸含量，并計(jì)算出每組數(shù)據(jù)的均值與方差(表1)。3組數(shù)據(jù)做方差分析，先做方差齊性檢驗(yàn)(表1)，雙樣本方差分析來(lái)判斷方差是異質(zhì)的。

然后再做t-檢驗(yàn)，雙樣本異方差假設(shè)，再判斷顯著性差異。結(jié)果得出，實(shí)驗(yàn)組(殼聚糖)與陽(yáng)性對(duì)照組(維生素E)兩組比較，t=4.4595，P<0.01，差異極顯著。陽(yáng)性對(duì)照組(維生素E)和陰性對(duì)照組(生理鹽水)兩組比較，t=3.4287，P<0.05，差異顯著。實(shí)驗(yàn)組(殼聚糖)和陰性對(duì)照組(生理鹽水)兩組變量比較，t=5.4186，P<0.01，差異極顯著。方差分析結(jié)果表明3組SD大鼠羥脯氨酸方差不同(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 3組SD大鼠皮膚羥脯氨酸含量(ng)比較

實(shí)驗(yàn)組，即由涂抹殼聚糖的大鼠背部皮膚制成的皮膚消化液的吸光度算出的羥脯氨酸含量與陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照相比均有差異。說(shuō)明殼聚糖能顯著提高大鼠皮膚組織中羥脯氨酸含量。

3.2 殼聚糖對(duì)大鼠皮膚組織形態(tài)學(xué)的影響

觀察HE 染色后的各組大鼠皮膚形態(tài)學(xué)差異(圖2)。實(shí)驗(yàn)組(殼聚糖)大鼠皮膚表皮角化層變薄，真皮層變厚，膠原纖維致密豐富，腺管擴(kuò)張，分泌旺盛；陽(yáng)性對(duì)照組(維生素E)大鼠皮膚表皮角化層無(wú)明顯變薄，真皮層無(wú)明顯變厚，真皮膠原纖維較多，皮脂腺分泌較旺盛；陰性對(duì)照組(生理鹽水)大鼠皮膚表皮角化層較厚，真皮層厚度較薄，膠原纖維相對(duì)稀疏，腺管無(wú)明顯擴(kuò)張，分泌不旺盛。

圖2 各實(shí)驗(yàn)組大鼠皮膚組織形態(tài)學(xué)差異(HE染色)

3 討論

皮膚皺紋是人體衰老常見(jiàn)表現(xiàn)之一。膠原纖維是皮膚真皮中的重要成分，其含量隨年齡增長(zhǎng)而明顯下降，從而使皮膚松弛，彈性降低。羥脯氨酸是膠原蛋白中最重要、含量最多而且最穩(wěn)定的氨基酸，約占膠原氨基酸總量的13%，其含量可間接反映出膠原纖維的含量，從而反映出真皮衰老程度[4]。大量研究表明，在延緩皮膚衰老的臨床及實(shí)驗(yàn)研究中，很多制劑的抗衰機(jī)理是通過(guò)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組皮膚羥脯氨酸含量的變化來(lái)體現(xiàn)的[4-5]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了實(shí)驗(yàn)各組大鼠皮膚組織勻漿中羥脯氨酸的含量，結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)組(殼聚糖)羥脯氨酸含量顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組(維生素E)及陰性對(duì)照組(生理鹽水)，說(shuō)明殼聚糖能顯著提高大鼠皮膚組織中羥脯氨酸含量，從而促進(jìn)皮膚膠原蛋白合成，提示具有增強(qiáng)皮膚彈性，延緩皮膚衰老的作用。從殼聚糖對(duì)大鼠皮膚組織形態(tài)學(xué)影響的實(shí)驗(yàn)可觀察到實(shí)驗(yàn)組相對(duì)陽(yáng)性對(duì)照(維生素E)和陰性對(duì)照(生理鹽水)，在形態(tài)學(xué)表現(xiàn)上皮膚表皮角化層變薄，真皮層變厚明顯，膠原纖維更加致密豐富，腺管擴(kuò)張，分泌旺盛。維生素E的抗氧化作用在大量的研究中證實(shí)具有抗皮膚衰老的作用[8-9]。無(wú)論是組織學(xué)觀察還是定量檢測(cè)，殼聚糖的抗大鼠皮膚衰老的能力要比維生素E更強(qiáng)。

殼聚糖作為一種天然高分子材料，具有資源豐富、價(jià)格便宜、安全無(wú)毒等眾多優(yōu)點(diǎn)，其應(yīng)用研究不斷深化。研究表明，殼聚糖具有調(diào)節(jié)免疫[10]，抑制腫瘤作用[11]，還具有抗衰老，延緩受試動(dòng)物老化等作用[2,3]。

殼聚糖在醫(yī)療美容、再生醫(yī)學(xué)、組織工程領(lǐng)域具有良好的研究前景，其抗皮膚衰老的研究目前尚少。Kong SZ等人研究了殼聚糖寡糖對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型小鼠可能的抗衰老作用，結(jié)果表明殼聚糖寡糖在D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老小鼠中具有明顯的抗衰老作用，其作用機(jī)制在一定程度上與提高抗氧化防御能力，減少氧化應(yīng)激和改善衰老的免疫功能有關(guān)[3]。但是，殼聚糖對(duì)皮膚的抗衰老機(jī)制仍待研究，可能與其分子內(nèi)存在游離的多個(gè)氨基，作為自由基吸收劑，迅速將一個(gè)氫原子提供給自由基，從而干擾自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)有關(guān)，作為自由基清除劑，在長(zhǎng)期應(yīng)用過(guò)程中能消除或減少誘發(fā)膠原蛋白產(chǎn)生共價(jià)鍵的交聯(lián)反應(yīng)。關(guān)于殼聚糖抗皮膚衰老的具體機(jī)制，以及其在人體內(nèi)能否得到驗(yàn)證，尚待進(jìn)一步研究。