魯 琛，劉 慧，范清秋，胡張捷，王 輝@

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院， 浙江 杭州 310009；2.湖州市中醫(yī)院， 浙江 湖州 313003；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)， 浙江 杭州 310053)

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是致殘率最高的慢性骨關(guān)節(jié)病[1]。隨著人口老齡化及肥胖癥患者的增多，其發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重危害人類健康[2]。肥胖是OA的重要病因，與其發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，關(guān)節(jié)應(yīng)力異常與脂代謝紊亂是肥胖引起OA的重要機制[3-4]。目前，臨床對OA的治療主要圍繞關(guān)節(jié)局部，往往忽略肥胖因素對疾病發(fā)展和療效的影響。飲食干預(yù)是控制體重的有效手段，亦是食療的重要方法，對預(yù)防或減輕肥胖患者OA進展有潛在作用[5-6]。然而飲食干預(yù)手段對OA輔助治療作用的基礎(chǔ)研究少見報道。本實驗應(yīng)用關(guān)節(jié)腔碘乙酸注射法建立大鼠OA模型，在關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸鈉的基礎(chǔ)上配合飲食干預(yù)，以揭示飲食干預(yù)對肥胖型OA的輔助治療作用。

1 實驗材料

健康SPF級雄性SD大鼠32只，碘乙酸，透明質(zhì)酸鈉注射液，MMP-13、Aggrecan、Col II酶聯(lián)免疫試劑盒，TC、TG、HDL-C，LDL-C試劑盒，高脂飼料；微量注射器，小動物成像儀，倒置顯微鏡等。

2 實驗方法

2.1 動物分組與模型制備

健康SPF級雄性SD大鼠32只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按照體重隨機分為4組：正常對照組、模型對照組、藥物治療組、飲食干預(yù)組，每組8只。除正常對照組給予普通飼料外，其余各組以高脂飼料。各組大鼠以碘乙酸法制備OA模型，僅正常對照組以相同方法于雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射等量無菌生理鹽水作為對照。術(shù)后均給予正常飲水、高脂飲食，連續(xù)4周。

2.2 藥物干預(yù)

第5周開始給予各組大鼠藥物干預(yù)，藥物治療組與飲食干預(yù)組膝關(guān)節(jié)腔注射透明質(zhì)酸鈉溶液0.1ml/只，每周1次，連續(xù)4周；正常對照組與模型對照組膝關(guān)節(jié)腔注射等劑量生理鹽水。

2.3 飲食干預(yù)

第5周開始，正常對照組與飲食干預(yù)組給予普通飼料飼養(yǎng)，模型對照組與藥物治療組仍給予高脂飼料飼養(yǎng)。

2.4 指標(biāo)觀察與檢測

每日觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、活動狀況、毛發(fā)、飲食飲水及排泄等情況，每周稱量大鼠體重并記錄；分別于第4、8周末，檢測大鼠空腹血脂TC、TG水平；第8周末，各組大鼠麻醉后依次進行：膝關(guān)節(jié)X-ray拍攝，觀察各組大鼠膝關(guān)節(jié)影像學(xué)的區(qū)別；心臟采血，ELISA法檢測血清中MMP-13、Aggrecan、Col II的含量；截取膝關(guān)節(jié)，脫鈣后分別進行HE染色與SO染色，光鏡下觀察各組大鼠膝關(guān)節(jié)病理學(xué)的區(qū)別。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

3 實驗結(jié)果

3.1 一般體征

實驗期間，正常對照組大鼠體征正常；模型對照組大鼠體征較差；藥物治療組與飲食干預(yù)組大鼠隨著給藥時間的增加，體征逐漸恢復(fù)。實驗期間各組大鼠無死亡。

3.2 體重

實驗期間，各組大鼠體重持續(xù)增長。經(jīng)重復(fù)測量方差分析，組間體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.644，P=0.069)；不同時間點體重差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1598，P<0.001)；體重在組間和時間上存在交互效應(yīng)(F=3.078，P=0.005)。經(jīng)簡單效應(yīng)檢驗，在第3周末，其余3組大鼠的體重與正常對照組相比均有差異(P<0.05)；第8周末，飲食干預(yù)組大鼠的體重與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但與模型對照組、藥物治療組相比均有差異(P<0.05)。表明飲食干預(yù)對OA大鼠體重增長的改變無顯著影響。見表1。

表1 飲食干預(yù)對OA大鼠體重的影響

3.3 血脂水平

重復(fù)測量方差分析，不同組間的TC、TG結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=25.539，P<0.001；F=12.906，P<0.001)；不同時間點的TC、TG結(jié)果差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=48.761，P<0.001；F=523.575，P<0.001)；TC、TG在組間和時間上存在交互效應(yīng)(F=6.894，P=0.001；F=77.517，P<0.001)。經(jīng)簡單效應(yīng)檢驗，造模第4、8周末，其余3組大鼠的血清TC與正常對照組相比均有差異(P<0.05)，且第8周末，飲食干預(yù)組大鼠的血清TC與模型對照組、藥物治療組相比均有差異(P<0.05)；造模第8周末，飲食干預(yù)組大鼠的血清TG與藥物治療組相比有差異(P<0.05)。表明飲食干預(yù)對OA大鼠血清TC、TG的改變更加顯著。見表2。

表2 飲食干預(yù)對OA大鼠血清TC、TG的影響

3.4 血清MMP-13、Col-II、Aggrean

經(jīng)單因素方差分析，造模第8周末，MMP-13、Col-II和Aggrean在不同組間存在差異(P<0.05)，經(jīng)LSD兩兩比較，相比于正常對照組，其余3組大鼠血清MMP-13含量顯著性升高(P<0.05)，Col-II、Aggrean含量顯著性降低(P<0.05)；但相比于模型對照組，藥物治療組與飲食干預(yù)組大鼠血清MMP-13含量均顯著性降低(P<0.05)，血清Col-II、Aggrean含量均顯著性升高(P<0.05)，且飲食干預(yù)組相比于藥物治療組改變更加顯著(P<0.05)。表明飲食干預(yù)對OA大鼠血清MMP-13、Col-II、Aggrean的改變更加顯著。見表3。

表3 飲食干預(yù)對OA大鼠MMP-13、Col-II、Aggrean的影響

3.5 膝關(guān)節(jié)X-ray

實驗結(jié)束時，通過X-ray可見：正常對照組大鼠膝關(guān)節(jié)正常；模型對照組大鼠膝關(guān)節(jié)明顯改變；藥物治療與飲食干預(yù)后，相比于模型對照組，各組大鼠膝關(guān)節(jié)的影像學(xué)均明顯改善，且飲食干預(yù)組相比于藥物治療組改善更加顯著。

3.6 膝關(guān)節(jié)病理

實驗結(jié)束時，通過HE染色與SO染色，光鏡下可見：正常對照組大鼠膝關(guān)節(jié)病理形態(tài)正常；模型組大鼠膝關(guān)節(jié)病理明顯改變；藥物治療與飲食干預(yù)后，相比于模型對照組，各組大鼠膝關(guān)節(jié)的病理均明顯改善，且飲食干預(yù)組相比于藥物治療組改善更加顯著。

4 討論

OA是除骨質(zhì)疏松癥以外最常見的慢性退行性骨關(guān)節(jié)病[7]，肥胖導(dǎo)致關(guān)節(jié)力學(xué)負荷增加，同時伴隨軟骨和韌帶的破壞，這是承重關(guān)節(jié)易患OA的主要原因。

本實驗為初步闡明飲食干預(yù)對肥胖型OA的藥物治療具有輔助作用，采用經(jīng)典的碘乙酸關(guān)節(jié)腔注射法建立大鼠OA模型，分別給予持續(xù)性高脂飲食與飲食干預(yù)，分別通過影像學(xué)手段與病理學(xué)手段檢測大鼠膝關(guān)節(jié)病理改變，分子生物學(xué)手段檢測大鼠體內(nèi)MMP-13、Collagen-II與Aggrecan的變化。實驗結(jié)果顯示，在造模8周后，影像學(xué)與病理學(xué)均顯示模型組大鼠的膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯的病理損傷，且血清中TC、TG、MMP-13含量顯著升高，Col-II、Aggrean含量顯著降低。造模后，經(jīng)過藥物治療與飲食干預(yù)4周，2組大鼠在血清因子、膝關(guān)節(jié)影像學(xué)、病理學(xué)上均有明顯改善，且飲食干預(yù)組大鼠的改善較藥物治療組更加顯著。上述實驗結(jié)果表明，在藥物治療的基礎(chǔ)上，飲食干預(yù)對碘乙酸誘導(dǎo)的大鼠骨性關(guān)節(jié)炎有較好的輔助治療作用。