金德蕙 王占想 宋亞麗

惡性黑素瘤(malignant melanoma)是一種高度惡性的黑素細(xì)胞腫瘤，早期手術(shù)徹底切除后預(yù)后尚可，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，對(duì)放療、化療均不敏感，5年生存率不超過(guò)14%。因此探討如何提高黑素瘤對(duì)放療、化療的敏感性，成為黑素瘤研究的熱點(diǎn)之一。

Bcl-2-associated athanogene 1(BAG-1)基因位于染色體9p12，其編碼蛋白BAG-1蛋白通過(guò)與多種靶分子結(jié)合，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)的多個(gè)環(huán)節(jié)。BAG-1蛋白主要通過(guò)其C末端與熱休克蛋白(HSP)70的肽結(jié)合區(qū)結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞增殖；還可通過(guò)激活Raf-1信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖；在細(xì)胞表面，BAG-1與酪氨酸激酶受體如干細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF/血小板衍生生長(zhǎng)因子PDGF受體結(jié)合能增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的凋亡；在細(xì)胞漿內(nèi)，可與Bcl-2結(jié)合以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡；在細(xì)胞核內(nèi)，可與多個(gè)核激素受體如維生素D3受體、維A酸受體結(jié)合而調(diào)節(jié)相應(yīng)核激素的表達(dá)與活性[1-3]。

臨床研究發(fā)現(xiàn)BAG-1蛋白在正常組織幾乎不表達(dá)或低水平表達(dá)，而在乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中高度表達(dá)。腫瘤細(xì)胞BAG-1基因表達(dá)上調(diào)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抵抗轉(zhuǎn)移能力，增加對(duì)凋亡刺激及化療的耐藥性；而下調(diào)其表達(dá)則增加腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡刺激、化療的敏感性[1,2]。

一般認(rèn)為黑素瘤對(duì)放療不敏感，但在某些特殊情況下放療仍是一項(xiàng)重要的治療手段。目前尚未見(jiàn)有關(guān)BAG-1對(duì)黑素瘤放射治療反應(yīng)影響的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討RNA干擾黑素瘤B16F10細(xì)胞BAG-1基因表達(dá)對(duì)放射線(xiàn)X線(xiàn)的敏感性的影響，并進(jìn)行細(xì)胞凋亡率檢測(cè)及相關(guān)機(jī)制探討。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及試劑 黑素瘤B16F10、M14細(xì)胞株購(gòu)自南京凱基公司， RMPI 1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品，LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen公司; 兔抗鼠BAG-1多克隆抗體 為Santa Cruz公司產(chǎn)品，兔抗鼠Caspase3、8、9、PARP一抗及聚合HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗(貨號(hào)BA1056)購(gòu)自武漢博士德公司。

1.2 構(gòu)建干擾質(zhì)粒pGCsi-BAG-1并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染黑色素瘤細(xì)胞，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率 構(gòu)建干擾質(zhì)粒pGCsi-BAG-1[4]。脂質(zhì)體Lipo2000轉(zhuǎn)染人黑素瘤細(xì)胞M14及鼠黑素瘤細(xì)胞B16F10，陰性對(duì)照組(NC-shRNA)黑素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染插入無(wú)關(guān)序列的干擾載體。具體操作如下：轉(zhuǎn)染前一天，將人黑素瘤細(xì)胞M14及鼠黑素瘤細(xì)胞B16F10接種到6孔培養(yǎng)板上，接種密度(3～4)×105/mL。轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞要達(dá)到90%～95%的融合。溶液1：按照無(wú)血清RMPI 1640培養(yǎng)基與lipofectamine 2000按照每孔240 μL∶10 μL比例混合，溫育5 min。溶液2：無(wú)血清RMPI 1640培養(yǎng)基與質(zhì)粒按照每孔240 μL∶4 μg比例混合。將溶液1與溶液2混合，室溫下置20 min。6孔培養(yǎng)板中的細(xì)胞用無(wú)血清RMPI 1640培養(yǎng)基沖洗兩遍，加入2 mL無(wú)血清培養(yǎng)基。將溶液1與溶液2的混合液逐滴加入孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻，37℃、5% CO2中保溫5～6 h后更換含有血清的全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，G418(600 μg/mL)篩選，獲得BAG-1表達(dá)沉默的B16F10細(xì)胞株，G418篩選后存活細(xì)胞擴(kuò)增用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，提取其RNA及蛋白，RT-PCR檢測(cè)BAG-1 mRNA變化，Western blot檢測(cè)BAG-1蛋白變化。

1.3 細(xì)胞放射敏感性試驗(yàn)

1.3.1 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞放射敏感性 人胚腎上皮細(xì)胞HEK293的基因表達(dá)類(lèi)似于神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞，對(duì)電離輻射較敏感，是輻射機(jī)制基礎(chǔ)研究的常用細(xì)胞株。本實(shí)驗(yàn)以HEK293細(xì)胞作為對(duì)照，研究M14、B16F10細(xì)胞對(duì)X射線(xiàn)照射的敏感性。將HEK293、M14、B16F10細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基、5% CO2孵箱37℃孵育，2～3 d傳代1次。取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞株，用胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后美國(guó)Varian Trilogy醫(yī)用直線(xiàn)加速器照射。根據(jù)不同的X射線(xiàn)照射劑量將細(xì)胞接種于直徑為100 mm培養(yǎng)皿中，照射X射線(xiàn)0、1、2、4、6、8 Gy的每皿1000個(gè)細(xì)胞，6、8 Gy的每皿2000個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)三個(gè)平行皿。照射24 h后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)14 d，至有克隆形成；倒去上清培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，加入75%甲醇固定液，鋪滿(mǎn)培養(yǎng)皿底面，固定5 min。棄去固定液，待稍干燥后加入0.5%結(jié)晶紫(甲醇配制)染色5 min，顯微鏡(低倍鏡)下檢查染色程度，當(dāng)克隆著色足夠時(shí)用水洗去殘余染液，以每團(tuán)細(xì)胞數(shù)>50個(gè)作為一個(gè)克隆計(jì)數(shù)，計(jì)算克隆形成率(克隆形成率=生成克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%) 和存活分?jǐn)?shù)(SF=受照射細(xì)胞的克隆形成率/對(duì)照細(xì)胞克隆形成率×100%)。描繪出的細(xì)胞存活曲線(xiàn)。

1.3.2 BAG-1基因沉默后黑素瘤細(xì)胞對(duì)放射線(xiàn)的敏感性 將未轉(zhuǎn)染的B16F10細(xì)胞(Control組)、陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞(NC-shRNA組) 和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BAG-1-shRNA的細(xì)胞(BAG-1-shRNA組)暴露于0、1、2、4、6、8Gy的 X 射線(xiàn)，于照射后24 h進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)，比較細(xì)胞放射敏感性差異。

1.3.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：將Control組、NC-shRNA組和BAG-1-shRNA組細(xì)胞濃度調(diào)整為5×106/mL，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。參照Annexin V/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明，流式細(xì)胞儀分析。在Annexin V高染而PI低染區(qū)域的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞。

Western blotting檢測(cè)BAG-1沉默對(duì)黑素瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase3、8、9、PARP表達(dá)的影響：提取Control組、NC-shRNA組和BAG-1-shRNA組細(xì)胞蛋白，SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后按半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜(NC膜)，5%的脫脂奶粉中封閉2 h, 1∶1000稀釋一抗孵育，室溫下于搖床孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min,加入1∶5000稀釋的二抗，室溫下，搖床孵育45～60 min,TBST洗膜3次，每次10 min，用LI-COR掃膜儀掃膜，紅外激光成像系統(tǒng)對(duì)待測(cè)蛋白進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)干擾BAG-1表達(dá)效率 如圖1所示，與Control組相比，BAG-1-shRNA組BAG-1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低,分別下降了68%、71%(P<0.05)。為驗(yàn)證質(zhì)粒的干擾效率，同時(shí)檢測(cè)了黑素瘤M14細(xì)胞轉(zhuǎn)染BAG-1-shRNA后BAG-1mRNA表達(dá)，顯示下降程度為70%，干擾效率類(lèi)似于B16F10細(xì)胞。

2.2 黑素瘤細(xì)胞放射敏感性體外試驗(yàn)

2.2.1 黑素瘤細(xì)胞放射敏感性檢測(cè) 見(jiàn)圖2。細(xì)胞存活曲線(xiàn)顯示人胚腎HEK293細(xì)胞對(duì)放射線(xiàn)較敏感，X線(xiàn) 8Gy劑量照射時(shí)存活率接近0，而黑素瘤細(xì)胞M14細(xì)胞和B16F10細(xì)胞的存活率分別為1.5%和1.9%(P<0.05)。

2.2.2 BAG-1基因沉默后黑素瘤細(xì)胞對(duì)放射線(xiàn)的敏感性 見(jiàn)圖3。BAG-1-shRNA組對(duì)X放射線(xiàn)敏感性增高，8 Gy照射存活率為0.32%，相比Control組1.9%，NC-shRNA組1.75%，存活率顯著降低(P<0.05)。

2.3 黑素瘤B16F10細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3.1 細(xì)胞凋亡率測(cè)定 見(jiàn)圖4。Control黑素瘤B16F10細(xì)胞組在X線(xiàn)照射后凋亡率由2.5%升高至7.1%，在轉(zhuǎn)染BAG-1-shRNA聯(lián)合X線(xiàn)照射后，BAG-1-shRNA組的凋亡率達(dá)到25.3%， NC-shRNA組9.2%，差異顯著(P<0.05)。

2.3.2 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè) 見(jiàn)圖5。黑素瘤B16F10細(xì)胞BAG-1-shRNA組的pro-PARP、pro-Caspase 3等酶原蛋白較Control組和NC-shRNA組明顯下降(P<0.05)，凋亡蛋白c-PARP及細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)蛋白c-Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9表達(dá)均較Control組和NC-shRNA組顯著增高(P<0.05)，尤其以c-PARP、c-Caspase 3的改變更為顯著。結(jié)果證實(shí)Caspase酶解級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與了BAG-1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)過(guò)程。

圖1 a：黑素瘤B16F10細(xì)胞轉(zhuǎn)染BAG-1-shRNA組BAG-1mRNA表達(dá)下降了68%，M14細(xì)胞轉(zhuǎn)染BAG-1-shRNA組BAG-1mRNA表達(dá)下降了70%；b、c:B16F10細(xì)胞轉(zhuǎn)染BAG-1-shRNA組BAG-1蛋白表達(dá)下降了71%

圖2 不同X線(xiàn)照射劑量，人胚腎HEK293細(xì)胞和黑素瘤M14細(xì)胞、B16F10細(xì)胞的存活曲線(xiàn)圖3 不同X線(xiàn)照射劑量，黑素瘤B16F10細(xì)胞Control組、轉(zhuǎn)染NC-shRNA組、轉(zhuǎn)染BAG-1-shRNA組的細(xì)胞存活曲線(xiàn)圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)黑素瘤B16F10細(xì)胞Control組、轉(zhuǎn)染NC-shRNA組、轉(zhuǎn)染BAG-1-shRNA組X線(xiàn)照射前、后的細(xì)胞凋亡率

圖5 Western blot法檢測(cè)黑素瘤B16F10細(xì)胞Control組、轉(zhuǎn)染NC-shRNA組、轉(zhuǎn)染BAG-1-shRNA組細(xì)胞凋亡蛋白c-PARP、c-Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9及其酶原pro-PARP、pro-Caspase 3的表達(dá)

3 討論

BAG-1蛋白是一種多功能蛋白，具有多種調(diào)節(jié)功能：(1)抑制細(xì)胞凋亡和應(yīng)激反應(yīng)；(2)調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)；(3)影響轉(zhuǎn)錄活性；(4)參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯后修飾-重組/降解，影響細(xì)胞黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移。干擾BAG-1表達(dá)可能通過(guò)抑制黑素瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞凋亡從而影響黑素瘤生物學(xué)行為及治療反應(yīng)[3]。Caspase半胱氨酸蛋白酶家族引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡過(guò)程的中心環(huán)節(jié)，BAG-1的過(guò)度表達(dá)能夠抑制Caspase的激活，從而能抑制諸如化學(xué)制劑、放射等誘導(dǎo)的凋亡[5]。因此，干擾BAG-1表達(dá)有可能通過(guò)促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮治療輔助效應(yīng)。

黑素瘤本質(zhì)上抵抗放療這一觀(guān)點(diǎn)最初源于細(xì)胞培養(yǎng)研究。臨床上，黑素瘤的輔助放療主要用于淋巴結(jié)清掃和某些頭頸部黑素瘤(尤其是鼻腔)的術(shù)后補(bǔ)充治療，可進(jìn)一步提高局部控制率[6,7]。放射增敏是指為增強(qiáng)射線(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，提高腫瘤的控制率和治愈率，應(yīng)用一些藥物或物理等方法來(lái)提高腫瘤細(xì)胞對(duì)射線(xiàn)的敏感性的過(guò)程[8]。

本研究顯示X放射線(xiàn)8 Gy劑量照射黑素瘤細(xì)胞M14細(xì)胞株和B16F10細(xì)胞株，其存活率分別為1.5%和1.9%，提示黑素瘤細(xì)胞對(duì)X放射線(xiàn)相對(duì)較抗拒。在RNA干擾BAG-1基因表達(dá)后，8 Gy劑量X線(xiàn)照射黑素瘤B16-F10細(xì)胞存活率為0.32%，提示RNA干擾BAG-1基因表達(dá)可顯著增高黑素瘤細(xì)胞對(duì)X放射線(xiàn)的敏感性，即具有放射增敏功能。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示黑素瘤B16F10細(xì)胞在X線(xiàn)照射后凋亡率為7.1%， 在干擾BAG-1基因表達(dá)聯(lián)合X線(xiàn)照射后其凋亡率則高達(dá)25.3%，差異顯著。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)RNA 干擾BAG-1基因表達(dá)可顯著增高黑素瘤B16F10細(xì)胞c-PARP、c-Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9等細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的水平，提示促進(jìn)細(xì)胞凋亡可能是干擾BAG-1基因表達(dá)所致放射增敏功能的機(jī)制之一。干擾黑素瘤細(xì)胞BAG-1表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究提示干擾黑素瘤細(xì)胞RNA基因表達(dá)可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)揮放射增敏功能，研究為臨床黑素瘤治療提供新的治療靶位和治療思路。